小鼠精原干细胞分离培养的实验方法与步骤！

一、产品信息

平台编号：Bio-114994

规格：1×10Cells/T25培养瓶

细胞信息：C18-4

细胞名称：小鼠精原干细胞

产品规格：T25培养瓶/1.5ml冻存管x2

细胞数量：1x10e6

保存温度：37 -198

运输方式：常温保温运输，干冰运输

培养基体系：DMEM高糖+10S+1%双抗

简介：小鼠精原干细胞C18-4取自ICR小鼠

用途：研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、细胞简介

小鼠精原干细胞分离自睾丸组织；精原干细胞是位于睾丸生精小管的生精上皮内的一群生精干细胞，是成体内的定向干细胞。精原干细胞的一些独特优势使其成为动物转基因的理想宿主细胞。精原干细胞的生理生化特性及其分裂增殖、分化等多项生命活动的调节机制的深入研究，精子发生机理的进一步阐明以及精原干细胞转染，异体、异种移植技术的实际应用，都迫切需要找到一种可行的方法将其分离纯化，以期得到较高产量和纯度的有活力的精原细胞用于体外培养。在哺乳动睾丸内，精子发生时一个受高度调控和持续的过程，精原干细胞（SSCs）一方面进行自我更新维持干细胞数量，另一方面又不断执行分化成各级生精细胞直至最后生成精子。精原干细胞定居在曲精细管上皮的基膜处，是哺乳动物精子发生的最原始细胞，也是动物体内一起能将遗传信息传递的干细胞。精原干细胞体外培养体系的建立，在生物学、医学、畜牧业生产及制备转基因动物等领域具有广阔的应用前景。精原干细胞（SSCs）是生精上皮近基底膜的一群细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，是哺乳动物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。

三、主要试剂

0.1%明胶、DPBS、0.25%胰蛋白酶、400目细胞筛、精原干细胞培养液、1 mg/mL胶原酶、7 mg/mLDNase、细胞基础培养液、DMEM-C、精原干细胞冻存液(Kubota et. al., 2004a and 2004b)（4条件下可以保存1个月）

四、主要设备

3.5 cm培养皿、400目细胞筛、12孔板、6孔板、冻存管、15 mL离心管、外科手术刀、外科手术剪、医用镊、二氧化碳培养箱、微量移液器、细胞计数仪、超纯水系统、超低温冰箱、实体解剖镜

五、实验材料

2～4只出生5～10天的小鼠。

六、实验步骤

1、分离小鼠睾丸细胞

向一个3.5 cm培养皿中加入1～2 mL预冷的DPBS。

脱臼法处死小鼠，用外科手术器械打开腹腔，取出双侧睾丸，置于培养皿中，去除白膜，将睾丸用DPBS洗2～3遍。

小心去除DPBS，向培养皿中加入1～2 mL 1mg/mL胶原酶，放置于37培养箱中孵育10～15 min。取出后用1 mL移液器小心吹打，将睾丸间质细胞吹散。

将胶原酶小心去除，然后用DPBS轻轻洗两遍，去除D-PBS，加入0.8 mL0.25%胰蛋白酶和0.2 mL 7mg/mLDNase，37培养箱中孵育10 min。取出后用1 mL移液器充分吹打至细胞完全分散。

加入5 mL细胞基础培养液终止胰蛋白酶反应。

将上一步的细胞悬液用400目细胞筛过滤到离心管。

室温1500 r/min离心5 min，弃上清，用精原干细胞培养液重悬细胞，并计数。

2、铺板和差异贴壁筛选

用0.1%明胶包被1块12孔板，放置于室温或者37、5%CO2培养箱30 min以上。

将细胞悬液转移到0.1%明胶包被过的12孔板中，细胞密度为2×105～4×105细胞/孔，每孔1 mL培养液。

放入37、5%CO2培养箱中培养过夜。

1 mL移液器反复吹打10～15次后将悬浮的细胞转移到另一12孔板中(Ryuet. al., 2005)。此时只有很少量的生殖细胞和大部分贴壁生长的体细胞残留在明胶铺被的12孔板上，而第二块板上生殖细胞相对富集(Oatleyet. al., 2006)。

3、培养及传代

隔天半量更换新鲜的精原干细胞培养液。

一周内，转移到第二块12孔板的细胞增殖并铺满孔底。第一次传代的时间取决于克隆生长的状况，推荐传代时间为开始培养后10～14天。

吸尽培养液，用DPBS轻轻洗两遍，每孔加入200 μl0.25%胰蛋白酶，37培养箱内孵育4 min，然后每孔加入1 mL细胞基础培养液终止胰蛋白酶反应。收集细胞悬液至15 mL离心管，室温1500 r/min离心5 min。弃上清后用精原干细胞培养液重悬细胞，按照1:1的比例重新铺板。克隆长到原来的大小大约需要10天，这时候将细胞再传一代（传代比例1:2）。

4、维持生长

从第三代开始，将细胞接种到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上。从分离开始30天左右细胞可以稳定传代。

细胞稳定后，传代时细胞密度为3×105细胞/六孔板的一个孔，每三天半量更换新鲜的精原干细胞培养液。

根据细胞增殖情况，每4～6天传代。

5、冻存与复苏

精原干细胞冻存复苏的方法与其他细胞相似(Avarbocket. al.,1996)。

（1）冻存

将离心后的细胞用精原干细胞冻存液重悬，密度为16×106～20×106细胞/mL。

1个冻存管分装1 mL细胞悬液。

用分步法或程序降温盒冻存细胞，液氮中可长期保存。

（2）复苏

提前一天准备铺有饲养层细胞的培养皿。

准备一个15 mL离心管，装有3 mL DMEM-C备用。

将冻存管置于37水浴锅，使细胞悬液迅速融化，然后将细胞悬液加入第步的离心管中。

室温1500 r/min离心5 min，去除上清，加入精原干细胞培养液重悬后接种到铺有饲养层细胞的培养皿上。