人细胞周期素D1(CYCLIN-D1)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

人细胞周期素D1(CYCLIN-D1)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人细胞周期素D1(CYCLIN-D1)的含量。

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人细胞周期素D1(CYCLIN-D1)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人细胞周期素D1(CYCLIN-D1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

二、样本要求

1、血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-81000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

3、组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4、细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

三、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

四、实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

五、应用

用于STAT3、VEGF和CyclinD1在人胃癌组织中表达及意义的研究：

应用免疫组化技术对胃癌中STAT3、VEGF、CyclinD1的表达水平及意义进行研究,探讨胃正常组织、胃良性病变组织和胃癌中STAT3、VEGF、CyclinD1表达水平的差异及与胃癌组织类型、浸润程度、淋巴结转移及TNM分期等临床病理特征的关系,以及三者之间的相关性,为采取有效方法阻断肿瘤转移、提高疗效、估计预后提供重要的理论依据。

材料和方法：取自手术标本及胃镜活检标本共90例,其中65例胃癌组织,25例胃良性病变组织,30例胃正常组织,其中30例胃正常组织取自胃癌手术标本两断端,经病理证实无癌细胞浸润或癌前病变。术前均未进行化疗或放疗,临床资料完整。应用免疫组化S-P法,检测胃正常组织、胃良性病变组织和胃癌组织中STAT3、VEGF和CyclinD1的表达水平,并观察它们与胃癌组织类型、浸润程度、淋巴结转移及TNM分期等临床病理特征的关系,以及三者之间的相关性,统计学处理采用SPSS 13.0统计软件,计数数据采用χ2检验或Fisher检验,相关分析采用Spearman等级相关。结果P＜0.05为有显著性差异。P＜0.01为有极显著性差异。

结果：

1、在胃癌组织中信号转导和转录活化因子（STAT3）、血管内皮生长因子（VEGF）、细胞周期素D1（CyclinD1）表达阳性率显著高于胃良性病变组织及胃正常组织（P＜0.01）。胃正常组织和胃良性病变组织中信号转导和转录活化因子（STAT3）、血管内皮因子（VEGF）、细胞周期素D1（CyclinD1）表达阳性率无明显差别（P＞0.05）。

2、胃癌组织中STAT3表达阳性率在低分化组为89.74%明显高于高、中分化组的40.00%、57.14%（P＜0.05）,高、中分化组无明显差别（P＞0.05）;已穿破浆膜组为92.86%明显高于未穿破浆膜组的62.16%（P＜0.05）;有淋巴结转移组为85.37%明显高于无淋巴结转移组的58.33%（P＜0.05）;III、IV期组为93.75%和92.31%明显高于I、II期组的60.00%和62.50%（P＜0.05）,I、II期组无明显差别（P＞0.05）,III、IV期组无明显差别（P＞0.05）;性别、组织学类型之间无显著性差异（P＞0.05）。

3、胃癌组织中VEGF表达阳性率在低分化组为92.31%明显高于高、中分化组的60.00%和80.95%（P＜0.05）,高、中分化组无明显差别（P＞0.05）;已穿破浆膜组为92.86%明显高于未穿破浆膜组的81.08%（P＜0.05）;有淋巴结转移组为90.24%明显高于无淋巴结转移组的79.17%（P＜0.05）;III、IV期组为93.75%和92.31%明显高于I、II期组的80.00%和81.25%（P＜0.05）,I、II期组无明显差别（P＞0.05）,III、IV期组无明显差别（P＞0.05）;性别、组织学类型之间无显著性差异（P＞0.05）。