昆虫卵巢细胞的背景与应用及培养步骤！

一、背景

昆虫卵巢细胞该细胞系源于雌性昆虫的卵巢组织，可以用于复制杆状病毒表达载体，细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

二、培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）昆虫卵巢细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

三、应用

用于基于微流控芯片的东亚飞蝗卵巢细胞培养技术研究：

东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis Meyen）是危害严重的农业害虫之一,同时也是良好的实验模型,但其细胞学研究却相对缺乏。

选取东亚飞蝗进行其卵巢细胞体外培养技术研究,再结合微流控芯片技术,设计了一种可用于动物细胞培养的微流控芯片,开展基于微流控芯片的东亚飞蝗卵巢细胞培养技术研究。

主要研究结果如下：

1、东亚飞蝗卵巢细胞体外培养技术的建立。利用传统培养平台,通过对东亚飞蝗卵巢细胞原代培养条件进行研究,得到适宜的培养方法：东亚飞蝗体表用75%乙醇消毒50 min,无菌解剖出的卵巢组织再次选用75%乙醇消毒5 min。卵巢组织直接剪碎成组织块培养于培养瓶中,接种时培养基添加量为0.5 ml,后续培养逐渐补充培养基。培养基选用L-15作为基础培养基并添加10%胎牛血清。结果表明东亚飞蝗卵巢细胞在培养3d左右开始有组织块贴壁生长,5d左右可观察到从组织周围迁移出形态各异的细胞,16d左右组织或细胞贴壁紧密并开始相互连接,拉网生长。

2、微流控芯片的设计、加工及测试。使用SolidWorks软件进行微流控芯片设计和三维建模,并对芯片进行流体力学仿真及加工工艺的优化,最后利用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y评价微流控芯片的细胞培养效果。结果显示,选用PMMA及PS作为微流控芯片的制备材料,8mm适宜作为芯片腔室的厚度,芯片加工方式适宜通过在180下热压键合20min及环氧树脂灌封胶粘合来完成。SH-SY5Y细胞成功培养于微流控芯片中,细胞形态正常,可持续增殖,且未发生微生物污染问题,说明本文设计的微流控芯片可满足动物细胞培养需求。

3、基于微流控芯片的东亚飞蝗卵巢细胞培养技术。在上述培养技术及芯片设计加工的基础上,开展了基于微流控芯片的东亚飞蝗卵巢细胞培养技术研究。结果显示卵巢细胞在芯片中培养至8d左右可观察到组织块贴壁,在适宜的条件下,目前东亚飞蝗卵巢细胞在微流控芯片的生长时间可达30天以上。