小鼠肾足细胞的培养步骤与处理方法及应用！

一、背景

小鼠肾足细胞分离自小鼠肾脏的上皮细胞样的贴壁原代细胞细胞系，主要用于肾足细胞的体外细胞研究实验。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM（推荐iCell-0001）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。换液频率，2-3天换液一次。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10S的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

三、应用

用于甘松饮干预高糖诱导的小鼠肾足细胞和肾小管上皮细胞自噬-凋亡的分子机制研究：

研究甘松饮（GSY）含药血清对高糖诱导的肾足细胞和肾小管上皮细胞的作用以及相关分子机制。

方法：体外培养小鼠肾足细胞（MPC5）和肾小管上皮细胞（TCMK-1）,加入葡萄糖液模拟高血糖环境,以GSY含药血清作为干预药物,设计实验为空白组（NOR）、模型组（MOD）、甘松饮高剂量组（H-GSY）、甘松饮中剂量组（M-GSY）、甘松饮低剂量组（L-GSY）。用高葡萄糖液和GSY干预后,在流式细胞仪上检测细胞凋亡率、活性氧水平（ROS）、线粒体膜电位（JC-1）,MDC法检测自噬体形成的多少。用Western Blot法分别检测两个细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase7和caspase9的表达,自噬标志蛋白LC3、P62的表达,以及检测足细胞中TSC1、m TOR、Atg5蛋白的表达,肾小管上皮细胞中SGLT2、SIRT1蛋白的表达。

结果：

1、GSY对高糖诱导的MPC5的影响:GSY含药血清干预细胞24H后,与模型组相比,GSY各剂量组细胞凋亡比例逐渐减少（P<0.05）,细胞活性氧堆积减少（P<0.01）,细胞内线粒体膜电位水平增加（P<0.01）,细胞中的荧光自噬体增多（P<0.01）,其中H-GSY组增多最明显。Western Blot显示:与Model组相比,凋亡相关蛋白中,GSY组中Bcl-2的表达量增多（P<0.01）,Bax、caspase7和caspase9的表达量减少（P<0.05）;自噬相关蛋白中,P62和m TOR表达减少（P<0.05）,Atg5和TSC1表达增加（P<0.05）。

2、GSY对高糖诱导的TCMK-1的影响:GSY含药血清干预后,与模型组相比较,GSY各剂量组内细胞凋亡比例减少（P<0.01）,细胞ROS水平降低（P<0.01）,细胞内线粒体膜电位水平增加（P<0.05）,尤其以M-GSY组和H-GSY组较为明显（P<0.01）,细胞内自噬体增加（P<0.01）。Western Blot显示:与Model组相比,GSY组的凋亡蛋白中Bcl-2表达上调（P<0.01）,Bax、caspase7和caspase9表达下调（P<0.05）;在自噬相关蛋白中,GSY组LC3、SIRT1蛋白表达量增加（P<0.05）,SGLT2、P62蛋白表达量减少（P<0.05）。

结论：

1、GSY可能通过降低细胞内ROS水平,提高线粒体膜电位,减少细胞凋亡,对高糖诱导的MPC5、TCMK-1细胞起到保护作用。

2、GSY能够下调m TOR,上调Atg5和TSC1,其机制可能是通过激活TSC1-m TOR-Atg5信号通路促进MPC5细胞的自噬。GSY可以下调SGLT2,上调SIRT1,其机制可能是通过激活SGLT2-SIRT1信号通路促进TCMK-1细胞内的自噬,减轻肾小球损伤。