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食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验方法!

(2023-03-04 21:20:05)
标签:

技术

方法

教育

分类: 微生物菌种

            食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验方法!

 


一、基础知识

 

1、生物学特性

 

形态特征:小肠结肠炎耶尔森氏菌革兰氏阴性杆菌或球杆菌,大小为(1-3.5)um×(0.5-1.3)um,多数情况单细胞零散存在,有时排列成短链或成堆;不形成芽孢,无荚膜;周生鞭毛。鞭毛的着生与环境条件有关:培养温度在30以下时,鞭毛形成,有动力;温度较高时即丧失,35以上则无动力。

 

培养特性:小肠结肠炎耶尔森氏菌兼性厌氧菌生长,温度为30-37,但在22一29该菌的某些特性才能出现;能在0-4可以生长繁殖,属于具有嗜冷性的致病菌;要求较高的水分活度,最低水分活度为0.95,pH接近中性,较低的耐盐性。对加热、消毒剂敏感。该菌代时较长,最短也需要40min左右。小肠结肠炎耶尔森氏菌在如在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上24h培养后菌落极小,48h可生成圆形、光滑、湿润、扁平、半透明的菌落,直径才增大成0.5-3.Omm;在麦康凯琼脂上菌落淡黄色,如若微带红色,则菌落中心的红色常稍深;在肉汤中生长呈均匀浑浊,一般不形成菌膜。CIN-1平板上,菌落较大,扁平,有明显的边缘,中心为深红色,整个边缘明显无色的小菌落(直径1-2mm)。

 

生化反应特性:小肠结肠炎耶尔森氏菌VP试验阳性、鸟氨酸脱羧酶阳性,能发酵山梨醇,甘露醇,不发酵鼠李糖、棉籽糖等。目前已知小肠结肠炎耶尔森氏菌生物型为1B, 2,3, 4, 5具有致病性,这些生物型和第6生物型不能快速水解七叶苷和发酵水杨苷。生物型6相当少,可以通过微弱发酵蔗糖加以区别,并且毗嗪酞胺酶均为阳性反应。目前,从血清型上来说,致病菌株是0:1, 2a, 3; 0: 2a, 3; 0: 3; 0; 8; 0: 9; 0; 4, 32; 0: 5,27; 0: 12, 25; 0: 13a, 13b; 0: 19; 0: 20; 0: 21。引起人类疾病的主要血清群是0:3,0:8,0:9和0:5,27。

 

2、致病性

 

小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersinia enterocolitica)广泛分布于自然界,是一种人畜共患的病原微生物,对人以肠道感染为主,并可成为各种疾病的病原。在食品和饮水等受到本菌污染时,往往可引起人的胃肠炎爆发,其症状表现与沙门氏菌食物中毒相似。是欧洲某些国家腹泻的主要病种,不少地区耶尔森氏菌引起的胃肠炎和严重腹泻,比痢疾还多。除肠道症状外,还能引起呼吸道、心血管系统、骨骼、结缔组织和全身疾病,出现败血症时病死率达30%以上。主要症状表现为发热,腹痛、腹泻、呕吐、关节炎、败血症等。耶尔森氏菌病典型症状常为胃肠炎症状、发热,亦可引起阑尾炎。本菌对易染人群为婴幼儿,常引起发热、腹痛和带血的腹泻。1981年我国才发现此病,引起全国重视,并开展了全国性调查和研究,分别从人群、动物和外环境分离出病原菌,证明耶尔森氏菌病在我国的分布是非常广泛的。

 

小肠结肠炎耶尔森氏菌分布很广,可存在于生蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、蛤和虾等食品及食品原料中。湖泊、河流、土壤和植被往往也存在于该菌;家畜、犬、猫、山羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中也能分离出该菌;港湾周围,许多鸟类包括水禽和海鸥可能是带菌者。

 

二、常用检验培养基及检测原理

 

常用小肠结肠炎耶尔森氏菌的选择分离培养基为CIN-1平板及改良Y琼脂。CIN-1平板是一种对耶尔森氏菌选择性较强的培养基,胰陈和酵母浸膏提供氮源和微量元素;甘露醇为可发酵糖;去氧胆酸钠和结晶紫抑制革兰氏阳性菌;中性红是pH指示剂。小肠结肠炎耶尔森氏菌在CIN琼脂上生长良好,发酵甘露醇产酸能使指示剂变红,所以菌落呈现红色。不同型的菌株,菌落大小有明显不同。

 

改良Y琼脂中蛋白胨和水解酪蛋白提供氮源和微量元素;乳糖用于糖发酵试验;氯化钠维持正常的渗透压,去氧胆酸钠和三号胆盐抑制革兰氏阳性菌;丙酮酸钠刺激目标菌的生长;琼脂是培养基的凝固剂。小肠结肠炎耶尔森氏菌不分解乳糖,所以在改良Y琼脂上不产酸,不能使指示剂孟加拉红变红,细菌不着色,故小肠结肠炎耶尔森氏菌为无色透明菌落。

 

三、国家标准检验方法

 

参照GB/T 4789. 8-2008《食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》。

 

1、检验程序

 

小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验程序如图4-34所示。

 

2、操作过程

 

1)增菌以无菌操作称取25g(或25mL)样品放入含有225mL改良磷酸盐缓冲液的无菌均质杯或均质袋中,以8000r/min均质l min或拍击式均质器均质I min。液体样品或粉末状样品,应振荡混匀。于26±1增菌48-72h。除乳及其制品外,其他食品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL充分混合15s。小肠结肠炎耶尔森氏菌比其他革兰氏阴性细菌生长慢,其生长往往易被掩盖。经弱碱液处理,立即接种选择性平板进行分离,提高小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率。

 

2)分离培养将乳及其制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种CIN-1琼脂平板和改良Y琼脂平板,于(26±1)培养48h±2h,小肠结肠炎耶尔森氏菌在CIN-1平板上红色牛眼状菌落;改良Y琼脂平板上生长为无色透明、不黏稠的菌落。

 

改良Y琼脂的分离率高于麦康凯和SS培养基,因此选用CIN-I和改良Y琼脂结合使用,可以达到较好的分离选择效果。

 

3)改良克氏双糖试验分别挑取上述可疑菌落3.5个,接种改良克氏双糖斜面,于26±1培养24h,改良克氏双糖管斜面和底部皆产酸者(变黄)不产气者被认为可疑耶尔森氏菌,做进一步的生化鉴定。

 

4)尿素酶试验和动力观察将改良克氏双糖可疑培养物接种到尿素培养基上(接种量要大,挑取一接种环,振摇几秒),放置于26培养2-4h,然后将尿素酶阳性者接种两管半固体琼脂,分别放置26和37恒温箱,培养24h检查,如在26有动力学阳性,进行镜检和进一步的生化试验。

 

5)革兰氏染色镜检将上述可疑菌落做涂片染色,进行显微镜观察,呈革兰氏阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,大小为(0.8-3.0) um × 0.8um。

 

6)生化特性鉴定将上述可疑的菌落做进一步的生化鉴定试验,主要有VP试验、鸟氨酸脱羧酶试验,山梨醇、甘露醇、蔗糖、棉籽糖、鼠李糖等发酵试验,所有的生化反应皆在26培养。VP试验阳性、鸟氨酸脱羧酶阳性、棉籽糖阴性、山梨醇阳性、甘露醇阳性、鼠李糖阴性、蔗糖有不同生化型的可判断为小肠结肠炎耶尔森氏菌(表4-22)。

 

注:+阳性;一阴性;d不同生化型。

 

综合以上生化特性结果,报告25g或25mL样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌

 

可选择使用两种生化鉴定系统(API20E或VITEKGNI+)中任一种,代替常规的生化鉴定。

 

API20E:从营养琼脂平板上挑取单个菌落,按照API20E操作手册进行并判读结果。

 

VITEK全自动细菌生化分析仪:从营养琼脂平板上挑取单个菌落,按照VITEKGNI+操作手册进行并判定结果。

 

7)血清学鉴定除进行生化学鉴定外,亦可做血清型别的鉴定。目前国内可生产27种O型血清因子,供各地使用,具体操作方法与沙门氏菌O因子血清分型相同。

 

四、FDA/BAM小肠结肠炎耶尔森氏菌检验

 

该法检验程序如图4-35所示。

 

小肠结肠炎耶尔森氏菌在麦康凯平板上为小的(直径1-2mm)、偏平、无色的或淡粉红色菌落。在CIN平板上为具有紧红色中心整个边缘明显无色的小菌落(直径1-2mm)。用接种针将所选菌落穿刺接种于赖氨酸精氨酸铁琼脂(LAIA)斜面,室温培养48h。在LAIA中的培养物会产生碱性斜面,酸性底层,不产生气体和H2S (KA-)的反应,被认为是尿素酶阳性的可疑耶尔森氏菌。去除在LAIA中产H2S或产气或尿素酶阴性的培养物。将LAIA斜面上的培养物划线接种于厌氧卵黄琼脂(AEY),置室温培养。使用AEY上的生长物进行纯度检查、脂肪酶反应(2-5d),氧化酶试验、革兰氏染色和生化试验的接种。耶尔森氏菌为氧化酶阴性、革兰氏阴性的杆菌。

 

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