NCI-H446 人小细胞肺癌细胞的背景与应用！

一、背景

NCI-H446人小细胞肺癌细胞是从一位小细胞肺癌患者的胸水中建立。细胞的原始形态并不具有小细胞肺癌特征。这个细胞株是小细胞肺癌的生化和形态学上的变种，表达神经元特有的烯醇酶和脑部肌酸激酶同功酶。左旋多巴脱羧酶、蚕素、抗利尿激素、催产素或胃泌激素释放肽未达到可检测水平。

C-myc DNA序列扩增约20倍，c-myc RNA比正常细胞增加15倍。最初传代培养基用添加10 nM氢化可的松,0.005 mg/ml胰岛素,0.01 mg/ml铁传递蛋白,10 nM 17-beta-雌二醇,30 nM亚硒酸钠的RPMI 1640,95%，胎牛血清,5%。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，20%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.将上清取出，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，和上清一起在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于Sirtuin 3增强小细胞肺癌NCI-H446化疗敏感性的实验研究：

在体外实验中观察并探讨SIRT3诱导SCLC细胞凋亡,增加SCLC的化疗敏感性的机制,再在体内实验中进行验证。通过研究SIRT3对突变型p53的调控机制,可能为SCLC的治疗提供新的突破点。观察过表达SIRT3的小细胞肺癌NCI-H446细胞对顺铂化疗敏感性的影响。

方法：

1、SIRT3增强小细胞肺癌NCI-H446细胞对顺铂化疗敏感性的体外研究培养NCI-H446细胞,实验设为对照（CON）组、转染空载质粒（NC）组、SIRT3组,顺铂（CDDP）组,SIRT3+CDDP组。MTT确定SIRT3联合顺铂的最佳浓度;Annexin V-FITC流式细胞术检测凋亡情况和JC-1检测线粒体膜电势;Western Blot检测Bcl-2,Bax,caspase8,Cleaved caspase-3,Cleaved caspase-9等凋亡相关蛋白的表达。

2、SIRT3增强小细胞肺癌NCI-H446细胞对顺铂化疗敏感性的机制研究SIRT3活性测定（荧光）试剂盒检测SIRT3去乙酰化酶活性;免疫荧光确定在细胞中SIRT3与突变型p53的共定位;免疫沉淀实验检验突变型p53与SIRT3及与多聚泛素蛋白K48的结合能力;加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132,Western Blot检测突变型p53泛素化及降解情况。

3、SIST3增强小细胞肺癌NCI-H446细胞对顺铂化疗敏感性的体内研究构建裸鼠小细胞肺癌NCI-H446皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分为CON组、SIRT3组、CDDP组及SIRT3+CDDP组。将携带SIRT3质粒的减毒沙门氏菌转入裸鼠体内。治疗方法采用腹腔注射,观察肿瘤生长变化,TUNEL染色检测肿瘤组织凋亡情况,免疫组织化学法检测SIRT3、突变型p53的蛋白表达;Western Blot检测SIRT3、突变型p53及凋亡相关蛋白的表达。

结果：

1、SIRT3增强小细胞肺癌NCI-H446对顺铂的化疗敏感性MTT检测SIRT3联合顺铂对细胞增殖情况的影响,并确定最佳联合浓度,结果显示,与CON组相比,SIRT3联合浓度为0.25μg/ml顺铂能够明显抑制NCI-H446细胞的增殖（P<0.05）。Annexin V-FITC染色后流式细胞术检测细胞凋亡发现,与CON组、NC组、CDDP组相比,SIRT3组、SIRT3+CDDP组都能够促进细胞凋亡的发生,SIRT3+CDDP组更加明显（P<0.05）;JC-1染色后流式细胞术检测发现与CON组、NC组、CDDP组相比,SIRT3组及SIRT3+CDDP组能够明显降低细胞内线粒体的膜电势,且SIRT3+CDDP组降低效果更显著（P<0.05）。Westem Blot结果显示SIRT3组及SIRT3+CDDP组能上调Bax,caspase8,Cleaved caspase-3,Cleaved caspase-9等促凋亡蛋白的表达,下调Bcl-2凋亡抑制蛋白的表达（P<0.05）。

2、SIRT3去乙酰化突变型p53,增加其泛素蛋白酶体降解,促进细胞凋亡。SIRT3活性测定（荧光）试剂盒检测SIRT3去乙酰化酶活性确定了SIRT3质粒的有效性,以及过表达的SIRT3蛋白具有活性;免疫荧光确定了SIRT3与突变型p53在细胞质中的共定位;免疫沉淀检测突变型p53与SIRT3及多聚泛素蛋白K48的结合能力,确定了SIRT3能够在细胞质中与SIRT3结合,直接去乙酰化突变型p53,并且其泛素化增加,加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132,Western Blot检测发现突变型p53表达恢复到CON组水平,说明突变型p53的减少是通过泛素蛋白酶体途径降解进行的。

3、SIRT3增强小细胞肺癌NCI-H446对顺铂化疗敏感性的体内研究构建裸鼠小细胞肺癌NCI-H446皮下移植瘤模型,结果显示从肿瘤体积的生长曲线来看,虽然与CON组或CDDP组相比,SIRT3组或SIRT3+CDDP组对肿瘤生长都具有显著抑制作用,但对肿瘤生长的最佳治疗效果是SIRT3+CDDP组。TUNEL染色结果说明联合治疗后细胞凋亡增多,Western blot检测瘤组织中的凋亡相关蛋白显示Bax及Cleaved caspase-3的表达增加,Bcl-2的表达减少,同时突变型p53的表达也减少。免疫组织化学结果显示联合治疗后突变型p53的表达减少更加明显。这表明在体内SIRT3可以抑制肿瘤生长,诱导细胞发生凋亡,进而增强化疗敏感性。