人胃腺癌细胞的背景与应用及培养步骤！

一、背景

人胃腺癌细胞源自一个未经治疗的切除肿瘤碎块。在培养基中植板率为34%。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株的影响及其分子机制研究：

目的：（1）通过作用于人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901的体外研究,比较迷迭香酸和迷迭香酸类似物-11对细胞生长的抑制作用。

（2）探究迷迭香酸类似物-11诱导人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901凋亡及其可能的机制。

方法：（1）MTT法检测迷迭香酸和迷迭香酸类似物-11分别对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901增殖的抑制作用。

（2）平板细胞克隆形成试验观察迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901集落形成能力的影响。

（3）细胞划痕实验观察迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901迁移能力的影响。

（4）Hoechst 33258染色法观察迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901的凋亡形态学改变的影响。

（5）流式细胞术检测迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901的早期凋亡和晚期凋亡的影响。

（6）荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901人表皮受体生长因子EGFR mRNA,凋亡相关基因Caspase-3 mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达水平的影响。

（7）免疫印迹法（Western blot）检测迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax相对表达量的影响。

（8）免疫印迹法（Western blot）检测迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901通路蛋白EGFR及其下游Akt/NF-κB通路、MAPK经典通路相关蛋白相对表达量的影响。

结果：1、迷迭香酸和迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901增殖的抑制作用:（1）迷迭香酸作用于MGC-803细胞24 h、36 h、48 h的IC50分别是175.792±1.406μmol·L-1、108.077±0.615μmol·L-1、68.282±1.349μmol·L-1。（2）迷迭香酸作用于SGC-7901细胞24 h、36 h、48 h的IC50分别是174.302±0.793μmol·L-1、124.547±2.287μmol·L-1、54.158±2.098μmol·L-1。（3）迷迭香酸类似物-11作用于MGC-803细胞24 h、36 h、48 h的IC50分别是72.781±0.975μmol·L-1、59.979±1.203μmol·L-1、40.625±0.623μmol·L-1。（4）迷迭香酸类似物-11作用SGC-7901细胞24 h、36h、48 h的IC50分别是73.299±2.011μmol·L-1、50.426±1.458μmol·L-1、37.684±0.579μmol·L-1。

2、迷迭香酸类似物-11对人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901生物学功能的影响:（1）平板细胞克隆形成试验可以看出,迷迭香酸类似物-11可显著抑制人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901的集落形成能力,且呈浓度依赖性。（2）从细胞划痕实验得出,迷迭香酸类似物-11能时间浓度依赖性地抑制人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901的迁移能力。（3）Hoechst 33258染色法结果表明,不同浓度的迷迭香酸类似物-11干预人胃腺癌细胞株MGC-803和人胃腺癌细胞株SGC-7901 48 h后,细胞核呈现典型凋亡形态学改变。（4）流式细胞术结果提示,迷迭香酸类似物-11作用于MGC-803细胞48 h后,低浓度组主要诱导MGC-803细胞晚期凋亡,而中、高浓度组均能诱导MGC-803细胞早期凋亡和晚期凋亡;迷迭香酸类似物-11作用于SGC-7901细胞48 h后,低、中浓度组主要诱导SGC-7901细胞早期凋亡,而高浓度组能诱导SGC-7901细胞早期凋亡和晚期凋亡。