人角膜上皮细胞的背景与应用及体外培养！

一、背景

人角膜上皮细胞分离自眼角膜组织；角膜系眼球外膜呈半球形向前突出的部分。占外膜的1/6，横为椭圆形，约11.5～12mm，垂直径约10.5～11mm，厚约1mm，中央部稍Chemicalbook薄约0.8mm；前面曲率半径均值为7.8mm，后面为6.8mm。角膜由致密结缔组织组成，可分为5层，即上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层及内皮细胞层。

角膜上皮细胞的体外培养对研究角膜的生理学、病理学、免疫学以及分子生物学都是极为重要的手段，常用于研究细胞代谢产物、病毒感染、各种生长因子和药物对细胞生长的影响。

二、人角膜上皮细胞体外培养

1、将供体角膜放于消毒过的容器上，上皮面朝上，用手术刀切成12个三角形组织片。应一刀切下，避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原基质的破坏和成纤维细胞的脱落。

2、将角膜组织片的上皮面朝向下，放入用鼠尾型胶原蛋白预处理的6孔培养板，每孔放4个组织块。

3、用镊子轻压组织片，以便使组织块与培养皿表面充分接触。将组织片放置20min，使其变干。

4、将一滴KGM轻轻滴于组织片上，在37和5%CO2条件下孵育过夜。尽管从眼库得到的供体角膜是用抗菌素的培养液保存的，但全部操作应在无菌条件下进行。

5、第2d，在培养皿中加入1ml培养液。在培养早期，可观察到细胞仅从角膜缘处迁出，但没有细胞从角膜或虹膜迁出。无血清培养液含有低浓度钙离子（0.15mmol/L），减少胶原基质降解，故这种培养液可减少成纤维细胞长出。

6、在植入角膜组织片后第5d，用镊子将组织片取出，再加入3ml培养液。取出组织片后，贴壁细胞继续增值。第2周，细胞生长形成单层，呈现上皮具有的典型卵石状排列特征。每个角膜约获得6×106个上皮细胞。每周换液2次。

7、扩增培养：取出组织片后，当细胞融合达70%-80%时，用PBS浸洗细胞。然后，在37条件下用胰蛋白酶-EDTA液处理4min。用含有10S的PBS终止消化。将细胞离心后，用KGM混悬。计数细胞，以1×104个/cm2密度将细胞接种于涂有FNC的培养皿。在37、5%CO2条件下培养。1d后换培养液。

三、应用

用于IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的分子机制及地塞米松对其抑制作用的研究：

IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8的分子机制,主要以三条经典的MAPKs信号通路,即ERK,p38和JNK信号通路,以及转录因子NF-κB为分子靶点,研究其在IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8中的作用以及IL-1β活化的三条MAPKs信号通路与IL-1β诱导的NF-κB亚基p65入核和IL-1β上调的NF-κB转录活性之间的内在联系。

方法：通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平,以及抑制三条MAPKs信号通路和转录因子NF-κB后,再给予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平。

采用Western blot技术检测给予和不给予IL-1β刺激的三条经典的MAPKs信号通路及NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平。通过细胞免疫荧光染色技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB亚基p65的亚细胞定位以及分别单独抑制三条MAPKs信号通路后再给予IL-1β刺激的HCECs p65的亚细胞定位；行双荧光素酶报告基因检测技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的转录活性及分别单独抑制三条MAPKs信号通路后再给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的转录活性。