兔子硫氧化还原蛋白(TRX)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

兔子硫氧化还原蛋白(TRX)ELISA试剂盒运用双抗体夹心ELISA酶联免疫法定量测定血清、血浆或其它相关生物液体样本中硫氧化还原蛋白(TRX)的含量。

二、实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被硫氧化还原蛋白(TRX)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的硫氧化还原蛋白(TRX)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

三、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

四、应用

用于硫氧化还原蛋白还原酶抑制剂Auranofin的抗肿瘤血管与放射增敏的基础研究：

体外观察Auranofin对肺腺癌细胞系A549的X线放射增敏效应。方法：采用MTT法检测Auranofin对人肺腺癌细胞A549和人肺大细胞癌细胞H460活性的影响,克隆形成法进行放射增敏实验,了解0、0.25μM、0.5μM和1.0μM的Auranofin预处理12h对A549细胞X线照射后存活分数的影响,通过多靶单击模型拟合成细胞存活曲线,了解各组细胞的放射敏感性参数。

结果：Auranofin对A549和H460细胞活性的抑制呈浓度依赖性和时间依赖性。1.0μMAuranofin对A549有放射增敏的作用最为显著。克隆形成实验分析auranfin预处理的A549细胞照射后的存活分数,经多靶单击模型拟合成细胞存活曲线,结果0、0.25μM、0.5μM和1.0μM Auranofin预处理组放射抗拒参数SF2分别为0.827、0.718、0.653和0.393,1.0μM Auranofin对A549细胞的放射增敏比为3.0（DO值比）。

结论：Auranofin可以增强NSCLC细胞的放射增敏性；

Auranofin对x线照射NSCLC细胞放射增敏的机制，研究Auranofin增加X线照射NSCLC细胞放射敏感性的机制。

方法：分光光度计法和Western Bloting法分别检测终浓度为0、0.5和2.0μM的Auranofin对A549细胞TrxRl活性和HO-1的影响。Western Bloting法检测2.0μM的Auranofin预处理对x线照射4Gy后凋亡下游信号JNK/P38磷酸化、凋亡抑制家族IAP、BCL2、TRAF表达,Bax转位,PARP活化的影响。JC-1法检测2.0μM Auranofin对X线照射4Gy后A549细胞线粒体膜电位的变化。

采用BIP抑制Bax的转移后,Auranofin对A549细胞放射敏感性的变化。

结果：Auranofin可以明显的减少TrxRl活性和HO-1的表达。经Auranofin预处理,X线照射后JNK/P38的磷酸化更加明显,IAP、BCL2、TRAF家族蛋白表达减少,Bax向线粒体的转位增加,线粒体膜电位下降,活化的PARP片段增加。BIP阻断Bax向线粒体的转位后,翻转了Auranofin对A549细胞放射增敏作用。

结论：Auranofin通过抑制TrxR活性和HO-1的表达,激活JNK/P38通路,抑制IAP、BCL2、TRAF表达,进而促进放射后Bax转位和细胞凋亡,增加非小细胞肺癌细胞的放射敏感性。

Auranofin对肿瘤血管新生的影响目的：了解Auranofin对非小细胞肺癌的血管新生的影响。

方法：Western biting检测0、0.5和2.0μM Auranofin对A549和H460细胞转录因子HIF1α,HIF2a和Spl,以及下游细胞因子VEGF单体和二聚体,VEGF165b单体和二聚体蛋白表达的影响。transwell小室法检测Auranofin对与A549细胞共培养的HUVECs侵袭能力的影响。

结果：Auranofin对A549细胞HIF1α的影响不明显,但增加H460细胞HIFla的表达。Auranofin可以减少A549和H460细胞HIF2α和Sp1的表达,VEGF单体和二聚体的表达,增加抑制性VEGF165b单体和二聚体的表达。Auranofin明显抑制与A549细胞共培养的HUVECs侵袭能力。