大鼠胸大动脉平滑肌细胞的应用与培养步骤！

一、背景

大鼠胸大动脉平滑肌细胞是分离自大鼠胚胎胸大动脉平滑肌的贴壁生长的原代细胞系，主要用于胸大动脉平滑肌细胞的体外细胞研究。

二、培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1)准备：DMEM+10S+1%P/S

2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：50sal medium+40S+10%DMSO。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于BRM调控动脉平滑肌细胞表型转化在胸主动脉夹层及胸主动脉瘤形成中的作用研究：

研究旨在明确主动脉壁中膜组织中BRM表达水平与TAA和TAD发生发展的相关性，并进一步探讨BRM调控VSMC表型转化参与TAA和TAD发病的机制，从而为该类疾病的预防、诊断和治疗提供理论依据和潜在靶点。

方法：

1、收集胸主动脉夹层及胸主动脉瘤患者的主动脉壁组织（主动脉夹层31例，胸主动脉瘤11例），排除遗传性疾病（如Marfan综合症等）导致的胸主动脉夹层及胸主动脉瘤；正常对照组标本（8例）取自同一时期在我院病理科于死亡24小时内进行尸检的病例及我科心脏移植受者。采用免疫组织化学染色方法明确BRM在病变及正常主动脉组织中的表达部位。采用Trizol法从新鲜组织中提取总RNA。采用实时荧光定量PCR方法检测TAA、TAD及正常主动脉组织中BRM基因mRNA的表达水平，并检测MMP家族中的MMP2和MMP9、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）家族中的caspase-3、平滑肌特异性基因中的α-SMA和SM22α以及细胞外基质成分Fibulin4和Elastin共7个基因mRNA的表达情况。采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）从蛋白质水平检测三组主动脉组织中BRM的表达。

2、构建含BRM开放阅读框的重组真核表达质粒pcDNA.BRM，转染人原代主动脉平滑肌细胞，48小时后鉴定转染效率。Trizol法提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR方法检测转染组及对照组细胞中MMP2、MMP9、caspase-3、α-SMA、SM22α、Fibulin-4、Elastin基因的mRNA表达水平。

结果：

1、主动脉壁中BRM的表达研究：免疫组织化学染色表明，TAA、TAD主动脉组织中膜中BRM的表达水平显著高于正常对照组织（P<0.05），此外TAA组BRM表达水平显著高于TAD组。实时荧光定量PCR提示，BRM信使RNA在TAA和TAD中的表达量均高于正常主动脉（P<0.05），且在TAA中的表达量高于TAD（P<0.05）。Western Blot结果提示，TAA、TAD和正常对照组中BRM蛋白的含量存在统计学差异（P<0.05），TAA中BRM蛋白含量最高，TAD次之。

2、主动脉中MMP2、MMP9、Caspase-3、α-SMA、SM22α、Fibulin4、Elastin mRNA表达情况：实时荧光定量PCR表明，在TAA和TAD中MMP2、MMP9基因mRNA表达水平高于正常对照组（所有P<0.05），α-SMA、SM22α和Elastin基因mRNA表达水平低于正常对照组（所有P<0.05），而各组间Fibulin4和caspase-3的mRNA表达水平并无统计学差异。

3、原代人主动脉平滑肌细胞转染BRM后MMP2、MMP9、caspase-3、α-SMA、SM22α、Fibulin4、Elastin信使RNA表达情况研究：实时荧光定量PCR检测提示转染组BRM基因mRNA表达水平较空白对照组升高（P<0.05），同时转染组MMP2、MMP9基因mRNA表达水平高于空白对照组（所有P<0.05），α-SMA、SM22α和Elastin基因的mRNA表达水平低于空白对照组（所有P<0.05），而Fibulin4和caspase-3的mRNA表达水平并无统计学差异。