人泼尼松龙(PS)ELISA试剂盒的应用与操作步骤！

一、背景

人泼尼松龙(PS)ELISA试剂盒用于体外定量测定人血清或血浆中泼尼松龙(PS)的含量。

实验原理：泼尼松龙(PS)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被泼尼松龙(PS)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的泼尼松龙(PS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

二、样本处理要求

1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3、尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

三、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

四、实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

五、应用

用于甲基泼尼松龙对人肾小球系膜细胞增殖抑制作用及其机制研究：

通过体外观察甲基泼尼松龙对人肾小球系膜细胞细胞增殖的抑制作用,及对某些周期蛋白和CDK激酶等蛋白表达的影响,探讨其对人肾小球系膜细胞细胞增殖的抑制作用及其机制。

方法：（1）利用四甲基偶氮唑盐法（MTT法）检测不同浓度（1mg/L、10mg/L、100mg/L）的甲基泼尼松龙处理后的人系膜细胞的增殖情况。

（2）用流式细胞仪检测不同浓度的甲基泼尼松龙（1mg/L、10mg/L、100mg/L）分别作用后的人系膜细胞中CyclinE、CyclinD1、P27Kip1、CDK2、CDK4表达的改变。

（3）利用Western blot法检测不同浓度的甲基泼尼松龙（1mg/L、10mg/L、100mg/L）分别作用后的人系膜细胞中CyclinE、CyclinD1、P27Kip1表达的变化。

结果：（1）与对照组相比,甲基泼尼松龙作用于人系膜细胞24小时后,浓度为1mg/L、10mg/L、100mg/L的甲基泼尼松龙能抑制系膜细胞的增殖,且随着甲基泼尼松龙浓度的增大,抑制作用更显著,呈一定的剂量效应关系。

（2）流式细胞仪检测后,与对照组相比,甲基泼尼松龙作用过的人系膜细胞CyclinE、CyclinD1、CDK2、CDK4表达显著下降（p＜0.05）,P27Kip1的表达显著上升（P＜0.05）,且随着浓度梯度的增高,下降或升高趋势越明显（p＜0.05）。

（3）Western blot去检测后,与对照组相比,甲基泼尼松龙作用过的人系膜细胞中CyclinE、CyclinD1表达显著下降（p＜0.05）,P27Kip1的表达显著上升（p＜0.05）,且随着浓度梯度的增高,下降或升高趋势越明显（P＜0.05）。

结论：甲基泼尼松龙在体外作用于人系膜细胞,可显著抑制细胞的增殖,并可以使细胞内CyclinE、CyclinD1、CDK2、CDK4蛋白的表达显著下降,使细胞内P27Kip1蛋白的表达显著上升,下降和上升作用均与浓度正相关。