XL1-BLUE感受态细胞的应用与操作方法！

一、背景

XL1-BLUE感受态细胞是采用大肠杆菌XL1-Blue菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可达107，－70保存几个月转化效率不发生改变。XL1-Blue菌株能保证高拷贝质粒稳定复制，recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。hsdR17突变导致EcoK核酸内切酶系统缺失，增强了外源DNA的稳定性和提取质量。lacIqZΔM15的存在使XL1-Blue菌株可用于蓝、白斑筛选。

二、XL1-BLUE感受态细胞基因型

recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44(rk-,mk+),relA1 lac[F'proAB lacIqZM15:Tn10(TetR)]

XL1-Blue感受态细胞能够利用蓝白斑筛选进行重组质粒的鉴定，是使用质粒或Lambda载体进行常规克隆的优良的克隆菌株。

XL1-Blue感受态细胞是核酸内切酶缺陷型（end A）宿主菌，这能够有效提升小提质粒DNA的质量。

XL1-Blue感受态细胞是重组缺陷型宿主菌（rec A），能够有效提升插入片段的稳定性。细胞内的hsdR基因突变，能够阻止克隆的DNA被EcoK核酸内切酶系统的酶切。

XL1-Blue感受态细胞中的F’附加体上面的lacIqZΔM15基因使得改宿主菌能够应用蓝白斑筛选进行克隆质粒的鉴定。

三、操作方法

1、XL1-Blue感受态细胞从-80拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2、42水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3、向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37，200rpm复苏60分钟。

4、5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5、将平板倒置放于37培养箱过夜培养。

四、应用

用于PDCoV猪源噬菌体单链抗体库的构建及抗N蛋白单链抗体的筛选研究：

利用噬菌体展示技术构建了猪源噬菌体单链抗体库,通过四轮筛选获得了能与PDCoVN蛋白特异性结合的噬菌体scFv,并对筛选到的scFv进行了真核表达,对其活性进行了验证,以期为该病毒的免疫检测和防治奠定一定的基础。

具体研究内容如下：1、PDCoV猪源噬菌体单链抗体库的构建从感染PDCoV的猪脾脏中提取RNA,并反转录获得cDNA,以此为模板扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,并利用重叠延伸PCR将其拼接为scFv基因。将scFv基因克隆至噬菌粒质粒pSEX81后,电转化XL1-Blue感受态细胞,构建猪源单链抗体基因文库。经测算,VH-VLκ累积库容约为6.5×107cfu/mL,VH-VLλ累积库容约为1.7×108 cfu/mL,经PCR鉴定插入基因片段大小的正确率约为80%。使用辅助噬菌体M13K07侵染初级基因文库,构建噬菌体单链抗体初级库,滴度为4.5×109 pfu/mL。

2、抗PDCoV N蛋白单链抗体的富集与筛选为了得到针对PDCoVN蛋白的特异性scFv,以原核表达的N蛋白为靶蛋白包被ELISA板,采用微孔板筛选法对抗体库进行4轮富集筛选以富集特异性噬菌体抗体,最终抗体库的富集倍数约为310倍。从第四轮筛选的平板上随机挑取84个单菌落进行PCR鉴定,其中阳性克隆为1 1个,经测序及序列比对分析,符合抗体可变区基因结构且无终止密码子的共有5个,最终经phage-ELISA验证得到3株亲和力较高的噬菌体抗体,分别为scFv-25、scFv-27和scFv-53。

3、特异性单链抗体的表达和活性检测为了得到有活性的scFv,将筛选得到的scFv基因克隆到真核表达载体pFUSE-hIgG-Fc2上,经测序验证后转染至293T细胞进行真核表达,最终成功表达两个scFv,并利用Protein A对其进行纯化。ELISA结果显示两株抗体都能与PDCoV反应而不与其他猪常见病毒反应,表明抗体特异性良好;Western blot结果显示所表达抗体可以与PDCoV反应;间接免疫荧光试验（IFA）显示两株抗体都能特异性识别PDCoV。