大鼠破骨细胞的使用与处理方法及培养技巧！

大鼠破骨细胞分离自骨组织和骨髓；破骨细胞是骨组织中的多核巨细胞，位于骨组织表面的浅凹处。目前一般认为破骨细胞是分离自骨骼外的造血系统，其前体可能属于造血干细胞的前单核细胞。破骨细胞的主要功能是维持骨吸收和骨形成的相对平衡，若失去这种平衡则发生病理性变化。因此多数学者从破骨细胞着手研究破骨细胞的结构、功能探讨骨吸收，形成相互平衡的机制。但破骨细胞是一种终末分化细胞，属于不增殖细胞群，不能增殖和传代，只能进行原代培养且存活时间较短。

一、产品信息

平台编号：Bio-73713

规格：1×10Cells/T25培养瓶

细胞信息：原代细胞

细胞名称：大鼠破骨细胞

培养条件：原代细胞取组织现分

组织来源：骨髓

用途：研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、细胞简介

破骨细胞(osteoclast，亦称bone-resorbing cells)是骨组织成分的一种，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨细胞与成骨细胞（osteoblast，亦称bone-forming cells）在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase)和组织蛋白酶K（cathepsin K)是破骨细胞主要标志。

三、细胞特性

1)组织来源于实验动物的正常关节组织。

2)细胞鉴定：抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5) 细胞生长方式：圆形，不规则细胞，贴壁培养。

四、产品的运输和保存

视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80的条件下保存1个月。

2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

五、方法简介

实验室分离的大鼠破骨细胞采用机械分离法/密度梯度离心法和骨髓单核细胞诱导法制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

六、质量检测

实验室分离的大鼠破骨细胞经TRAP染色检测，纯度可达30%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

七、细胞处理

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

八、细胞培养技巧

1、在冷冻保存之前，应观察细胞生长是否良好(log phase) 且存活率高，冻存的细胞密度为80 – 90 ％最佳

2、冷冻前检测细胞是否保有其特有性质，例如是否有杂细胞或者支原体等。

3、使用的DMSO 应为试剂级等级，以5~10 ml 小体积分装，4 度避光保存，勿作多次解冻。使用的甘油也应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

4、冷冻保存的细胞浓度：

4-1.正常的成纤维细胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2.杂交瘤细胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些杂交瘤会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后。

4-3.贴壁肿瘤细胞: 1 x 10^6，依细胞种类而异。腺癌类的细胞解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4.悬浮细胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴类细胞须至少5 x 10^6 cells/ml。

5、冷冻保护剂浓度为5 %或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

九、使用方法

收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1、取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37，5% CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3、细胞传代

1)吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37温浴3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37，5% CO2细胞培养箱中培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。