大鼠真皮成纤维细胞的操作步骤与应用！

一、背景

大鼠真皮成纤维细胞分离自大鼠皮肤组织采用酶解法制备而来，波形蛋白（vimentin）免疫荧光染色呈阳性，细胞纯度可达90%以上，且不含有hiv-1、hbv、hcv、支原体、细菌、酵母和真菌等。

真皮主要由成纤维细胞及其产生的纤维、基质构成，并有血管、淋巴管、神经、皮肤附属器及其他细胞成分。该细胞主要分布于黏膜和皮下疏松结缔组织，胞质内富含嗜碱性颗粒，细胞表面能够表达高亲和力fcεri，可结合游离ige，参与i型超敏反应。

大鼠真皮成纤维细胞多呈长梭形，具有突起，细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松色浅，核仁明显。刚分离的大鼠真皮成纤维细胞呈圆形，较亮，培养40min左右贴壁，12～24 h左右伸展，36～48h进入对数生长期。分离纯化3d后接近融合，并彼此连接成网状。

二、细胞操作

1、取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3、细胞传代

1)吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37温浴3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37，5%CO2细胞培养箱中培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

三、应用

用于十全大补汤配伍不同剂量肉桂对氧化损伤大鼠真皮成纤维细胞的影响研究：

探讨十全大补汤配伍不同剂量肉桂对氧化损伤大鼠真皮成纤维细胞的调节作用,从细胞水平研究十全大补汤配伍不同剂量肉桂对氧化应激介导的慢性难愈性创面的作用机制。

方法：采用原代培养组织块法获得大鼠真皮成纤维细胞。采用十全大补汤原方及调整肉桂剂量所得的三组方药灌胃Wistar大鼠,制备5组不同的含药血清,分别为正常对照组、去肉桂组、原方组、2倍肉桂组及4倍肉桂组。采用一定浓度的H2O2刺激大鼠真皮成纤维细胞,制备细胞氧化损伤模型。用各组大鼠血清对氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞实施干预,采用MTT法检测四组药物对氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响；采用PI单染法和PI/Annexin V双染法结合流式细胞术检测四组药物对氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞周期和凋亡的影响；采用DCFH-DA探针和JC-1探针结合流式细胞术检测四组药物对氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞细胞内活性氧水平和线粒体膜电位的影响。

结果：1、浓度在100-1000umol/L范围内的H202刺激大鼠真皮成纤维细胞30min,可明显抑制细胞增殖,细胞增殖抑制率（IR）随H202浓度增高而依次增高。当H202浓度为500umol/L时,IR约为50%,可作为诱导细胞氧化损伤的合适浓度。

2、500umol/L H2O2刺激大鼠真皮成纤维细胞30mmin后,MTT法测得的OD值明显降低；GO/G1期细胞比例明显增高,S期和G2/M期细胞比例明显降低；细胞凋亡率明显增高；线粒体膜电位明显降低；细胞内活性氧水平显著上升。

3、MTT法检测细胞增殖结果中,氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞给予药物干预24h后,10%血清浓度组中2倍肉桂组和4倍肉桂组OD值升高；15%浓度组中2倍肉桂组OD值明显升高。药物干预48h后,5%浓度组中2倍肉桂组和4倍肉桂组OD值明显升高；10%浓度组中2倍肉桂组OD值明显升高。在四个用药组中,2倍肉桂组在两个时间点上的OD值均为最高。

4、细胞周期检测结果中,氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞给予药物干预24h后,四个用药组G0/G1期细胞比例均显著降低,S期和G2/M期细胞比例均显著增高。药物干预48h后,原方组、2倍肉桂组和4倍肉桂组G0/G1期细胞比例降低,S期和G2/M期细胞比例增高。在四个用药组中,2倍肉桂组在两个时间点上的细胞增殖指数均为最高。

5、细胞凋亡检测结果中,氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞给予药物干预24h及48h后,四个用药组细胞凋亡率均明显降低。在四个用药组中,2倍肉桂组在两个时间点上的细胞凋亡率均为最低。

6、线粒体膜电位检测结果中,氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞给予药物干预24h后,只有2倍肉桂组明显提高了线粒体膜电位。药物干预48h后,四个用药组对线粒体膜电位无明显影响。

7、活性氧检测结果中,氧化损伤的大鼠真皮成纤维细胞给予药物干预24h及48h后,四个用药组活性氧水平均显著降低。

结论：十全大补汤配伍不同剂量肉桂可以通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、清除细胞内活性氧的途径,对氧化损伤大鼠真皮成纤维细胞起到保护作用。