大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶A(MSRA)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶A(MSRA)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫法检测样本中甲硫氨酸亚砜还原酶A(MSRA)的含量。

原理：依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

二、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于甲硫氨酸亚砜还原酶A与小分子药物的相互作用研究：

探究四种黄酮类药物是与MsrA的相互作用。

方法：将含有重组表达载体BL21-pET28a/hMsrA大肠杆菌培养并异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG）诱导表达后,利用Ni-NTA亲和层析的方法获得有活性高纯度的hMsrA蛋白。10%的SDS-PAGE胶电泳鉴定hMsrA的蛋白纯度。利用荧光光谱滴定法和BIAcoreT200分子互相作用系统检测并分析四种黄酮类小分子原花青素、槲皮素、甘草酸、异甘草素与MsrA之间的相互作用。二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol,DTT）氧化法检测黄酮类小分子物质对MsrA活性的影响。

结果：（1）经SDS-PAGE胶电泳和蛋白酶活性的检测显示,Ni-NTA亲和层析法可获得高纯度高活性的hMsrA蛋白。

（2）A):荧光光谱滴定实验结果显示:在280nm的激发波长条件下,随着黄酮类小分子物质浓度的不断增加,引起MsrA的内源荧光发生淬灭,表明这些药物小分子可与MsrA发生相互作用。

但异甘草素与其他三类小分子间存在差异性,随着异甘草素浓度的不断增加,MsrA的荧光波峰位置发生了蓝移,表明MsrA蛋白的芳香族氨基酸残基微环境的极性发生了改变。

B) :随着温度（291K、298K、303K、310K）的不断增加,四个黄酮类小分子物质对MsrA作用的淬灭常数KQ不断减小,表明这四个黄酮类小分子物质与MsrA相互作用的淬灭过程以静态淬灭为主。

C):在不同温度下绘制黄酮类小分子物质与MsrA的Lg[（F0-F）/F]Lg[Q]的双对数图,根据截距和斜率求得相应的Kb和n。