H9C2大鼠心肌细胞的培养步骤与应用！

一、背景

H9C2大鼠心肌细胞是原始克隆细胞系的亚克隆，该细胞系由Kimes.和Brandt.从胚胎BD1X大鼠心脏组织获得，并显示出骨骼肌的许多特性。这个细胞株中的成肌细胞能融合形成多核的肌管，并对乙酰胆碱的刺激发生反应。如果培养基中的血清浓度下降到1%，融合发生得很快。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

3、传代方法：

（1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

（2）加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

（3）按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

（4）收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

三、应用

用于大鼠心肌细胞Hsp60/Hsp10的表达及抗热应激损伤机理研究：

通过对大鼠和离体培养的鼠源H9C2心肌细胞进行不同时间的热应激处理,拟动态观察和了解热应激大鼠心肌细胞中Hsp60及其相应mRNA的转录和表达水平,以及Hsp60在体内、外心肌细胞中的定位和分布等特点,研究热应激过程中Hsp60的变化规律与大鼠心肌细胞热应激损伤的相关性,探讨Hsp60的组织细胞保护机制。

为研究热应激对体内、外大鼠心肌细胞造成的应激性损伤及其程度,本试验通过病理学检测,观察了受试大鼠心肌细胞和鼠源H9C2心肌细胞在遭受不同时间的热应激处理后所呈现的应激性损伤变化。试验结果显示,热应激处理初期,受试大鼠的呼吸频率加快,被毛粗乱,烦躁不安,随后大量出汗,俯卧少动。待热应激处理至60 min时出现大鼠的热应激猝死,热应激处理100 min后,50%的受试大鼠猝死,热应激处理2 h内,100%的受试大鼠发生猝死;离体培养的H9C2心肌细胞在遭受热应激的时间达60 min时,细胞的活力和存活率开始显著下降,热应激处理240 min后,约50%的H9C2大鼠心肌细胞死亡。

说明离体培养的H9C2大鼠心肌细胞对热应激的耐受时间更长;组织病理学结果显示,热应激处理20 min后大鼠心肌细胞肿胀,心肌细胞质浑浊,呈现明显的颗粒变性。热应激处理40 min组大鼠的部分心肌细胞发生明显的颗粒变性,细胞质嗜酸性显著增强。热应激处理至100 min组大鼠的心肌细胞断裂较为明显,心肌细胞核浓缩;细胞病理学结果显示,20 min热应激处理组H9C2大鼠心肌细胞的体积肿大,形态变圆,细胞浆内出现少量的红染颗粒。40 min热应激处理组心肌细胞的胞浆内出现较多的红染颗粒。60 min热应激处理组H9C2大鼠心肌细胞出现脱落现象,细胞形态变圆且细胞边缘出现不规则的突起,细胞体积显著变大,胞浆内出现大量密集分布的红染颗粒。

热应激导致的大鼠心肌细胞和离体培养鼠源H9C2大鼠心肌细胞的病理学变化均随着热应激处理时间的延长而加剧,但离体培养心肌细胞表现出更强的热应激耐受性。为研究动物心肌细胞内Hsp60表达变化在热应激性心肌损伤以及动物猝死中的作用,本试验通过热应激过程中体内、外大鼠心肌细胞中Hsp60及其相应mRNA的表达水平和在细胞的定位等进行了动态观察,并对Hsp60表达改变与心肌的热应激损伤的相关性进行了比较分析。

结果显示,体内、外大鼠心肌细胞中Hsp60蛋白及其mRNA表达量随着热应激时间的增加而显著升高,虽然Hsp60蛋白在体内、外的表达水平未出现在同一时间点的一致升高,但其表达变化出现的时间与各自细胞组织病理学损伤程度相一致。Hsp60的表达变化反映了体内、外心肌细胞损伤程度的变化;不管是在体动物的心肌细胞还是离体培养的H9C2大鼠心肌细胞,Hsp60蛋白都只存在于心肌细胞的细胞浆,细胞核中没有检测到Hsp60的分布。但随着热应激时间的延长,Hsp60在细胞内的分布逐渐向细胞膜方向扩散,说明热应激可能会导致大鼠心肌细胞内的Hsp60发生跨膜转移。