睾丸酮丛毛单胞菌的分离方法及相关研究！

环境正遭受到类固醇化合物的严重污染，人类健康面临着重大威胁，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)对类固醇化合物的降解作用为我们对类固醇化合物污染的治理。睾丸酮丛毛单胞菌(comamonastrstosteroni)是丛毛单胞菌属的一个种，在自然界中分布广泛，为条件致病菌，可引起呼吸道等部位的感染。国内尚未见从血液中分离出该菌的报道。我们从血液培养中连续两次分离出同一种睾丸酮丛毛单胞菌。

一、菌种简介

睾丸酮丛毛单胞菌 ( C.testosteroni)是丛毛单胞菌属( Comamonas)的一个种 ,在自然界中分布广泛 ,为条件致病菌,可引起呼吸道等部位的感染。国外已有从血液、脓液、尿液和呼吸道分泌物等临床标本分离出该菌的报道 。我们从血液培养中连续两次分离出同一种睾丸酮丛毛单胞菌。睾丸酮丛毛单胞菌 ( C.testosteroni)是丛毛单胞菌属( Comamonas)的一个种 ,在自然界中分布广泛 ,为条件致病菌 ,可引起呼吸道等部位的感染。国外已有从血液、脓液、尿液和呼吸道分泌物等临床标本分离出该菌的报道 ,但作者尚未见国内有关报道。

二、睾丸酮丛毛单胞菌的特征特性

营养体:粗长杆状,两端钝圆,革兰氏染色反应不定,产生聚β-*盐(PHB)颗粒。菌体大小为(1.0~1.2)×?(2.5~7.0)μm?,菌体周围有厚荚膜。芽孢:壁厚,椭圆形,中生或近端生,芽孢囊不膨大或微膨大。菌落圆形,无色,隆起,胶质粘稠,透明或半透明,边缘整齐。好氧或兼性厌氧生长,水解淀粉,接触酶反应阳性,氧化酶和卵磷脂酶反应阴性,在无氮培养基上生长良好,生长温度10??~?45?。

三、睾丸酮丛毛单胞菌的特点

1、该菌具有解磷、解钾的功能。

2、具有活化土壤中硅、钙、镁中量元素作用。

3、具有提高铁锰铜锌钼硼供应的功效。

4、提高或延长肥效,减少化肥用量。

5、提高作物抗逆性,预防或减轻病害。

四、血液中分离出睾丸酮丛毛单胞菌

而睾丸酮丛毛单胞菌胞菌在降解类固醇、多环芳烃类物质 PHAs 等稳定原始菌株只具有 Amp 抗性，只能生长在含 Amp 的污染化合物中具有重要作用 Coulter and Talalay 培养基中生长，不能在含有这两种抗生素的培养基1968 Goyal and Zylstra 1996mobuset al. 1997 中生长。Mobus and Maser 1998 Maser et al. 2000 2001 bp M 1 2Skowasch et al. 2002，在污染环境修复中扮演着重要的角色。睾丸酮丛毛单胞菌的 3琢HSD/CR 是一种 15000 10000诱导酶，在该细菌染色体上 3琢HSD/CR 基因的上游 7500 5000存在两个 10 bp 的回文操纵基因序列，该基因附近还存在两个抑制子 RepA 和 RepB， 通过转录和翻译抑 2500 2000制该基因的表达 Xiong and Maser 2001 Xiong et al.2001 2003a b c。 1000 活化因子activator是指与增强子或与活化因子 750结合区域结合的蛋白，能够提高转录的起始速度 500Browning and Busby 2004。戴艺民等2005 2006将 250来自睾丸酮丛毛单胞菌的全长 564 bp 和部分409 100bp activator 分别与来自睾丸酮丛毛单胞菌的3琢HSD/CR 在体外进行共转化研究，

五、结果表明睾丸

1 PCR 筛选工程菌酮丛毛单胞菌的 activator 能提高 3琢HSD/CR 转录 Figure 1 Genetically engineered bacteria screened by PCR速率。 C. Wide range DNA marker 10015 000 1： test pa M：由于人工合成和生物自身代谢排入环境中的类 C. 2：testpb固醇污染物与日俱增，有必要对睾丸酮丛毛单胞菌.基因工程菌的 Southern 检测进行改造，提高该细菌的 3琢HSD/CR 等一系列降解酶基因的表达，才能达到利用睾丸酮丛毛单胞菌快提取睾丸酮丛毛单胞菌野生菌在图简写为速降解该类污染物、净化环境的目的。 本研究利用电 C. C. test，下 同 、testpa和 C. testpb 的染色体穿孔法将重组质粒 pKtac1act1 和 pKtac1act2 整合 DNA， EcoR玉酶切后进行杂交检测， ddH2O 作用 以化入睾丸酮丛毛单胞菌的染色体中，筛选得到 2 株 为阴性对照，以 EcoR玉酶切 pKtac1 作为阳性对照。睾丸酮丛毛单胞菌基因工程菌，对这两株基因工程 Southern 杂交的结果。从 Southern 杂交图可菌的关键酶 3琢HSD/CR 表达情况和细菌稳定性进见 ，基 因 工 程 菌 C .testpa 和 C.testpb 的染色体行检测分析，以期为进一步利用工程菌提供理论基 DNA 有明显的杂交条带，睾丸酮丛毛单胞菌的染色础。体 DNA 没有杂交条带的出现。由于睾丸酮丛毛单胞菌的染色体上不存在 pK18 的片段，而在挑选出来的1 结果与分析 基因工程菌的染色体上能够检测到 pK18 的片段的1.1 利用 PCR 筛选基因工程菌存在，由此可见质粒 pKtac1act1 和 pKtac1act2 确实整合入睾丸酮丛毛单胞菌的染色体中。质粒电穿孔转化后的细菌在含有 Amp 和 Kan的 LB 固体培养基上 30 过夜培养。挑选单克隆在 1.3 睾丸酮对细菌的诱导含有 Amp 和 Kan 的 LB 液体培养基中进行过夜振睾丸酮丛毛单胞菌的 3琢hsd/CR 是受睾丸酮诱荡培养，提取重组子的染色体 DNA 作为模板， A1 以导的酶。在 LB 培养基中添加睾丸酮对 Comamonas和 A2 为引物进行 PCR 扩增，扩增产物用 1.0的琼 C. testosteroni、 testpa 和 C. testpb 进 行过夜培养 ，脂糖凝胶进行电泳 图 1。筛选到 2 株基因工程菌，睾丸酮的终浓度为 270 滋g/mL。分别提取这 3 个菌即质粒 pKtac1act1 同源整合入睾丸酮丛毛单胞菌株的总蛋白，将细菌的总蛋白定量为 1 mg/mL， 稀释染色体产生的工程菌 C. testpa 和质粒 pKtac1act2 100 倍后，用 ELISA 法检测 3琢HSD/CR 的表达量，同源整合入睾丸酮丛毛单胞菌染色体产生的工程菌结果。从中可见，睾丸酮丛毛单胞菌野睾丸酮丛毛单胞菌工程菌构建及稳定性分析。