RBL-2H3细胞的处理方法及应用！

一、背景

RBL-2H3细胞是1978年国立牙科研究所的免疫学实验室从Wistar大鼠保持肿瘤状态的嗜碱性细胞中分离和克隆出来的嗜碱性白血病细胞株。这些细胞具有高亲和力的IgE受体。通过集聚这些受体或与钙离子载体协同作用可以激活它们分泌组胺及其他递质。这株细胞广泛地用于研究肥大细胞FcERI和分泌的生化途径。RBL-2H3细胞是研究FcERI结构的模型。它们广泛地用于研究细胞分泌的不同方面，包括细胞内钙浓度改变、磷酸脂酶激活、蛋白激酶和小G蛋白的作用。

二、细胞处理方法

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于温度对大鼠腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞活力和功能的影响研究：

探究不同温度对于大鼠腹腔提取的肥大细胞和RBL-2H3细胞活力和功能的影响

研究方法：1、选用体重220-250 g的SD雄性大鼠,使用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠腹腔肥大细胞,采用甲苯胺蓝染色,c-kit抗体标记、流式细胞术鉴定细胞纯度。

2、选取培养2h,4h,6h,12h,24 h,48 h,72 h时间点,CCK8法检测35。C和37培养条件下的腹腔提取的肥大细胞及RBL-2H3细胞增殖活力的变化。

3、3.35和37下培养腹腔提取的肥大细胞及RBL-2H3细胞,使用外源性刺激物C48/80和IgE刺激细胞脱颗粒,并使用肥大细胞稳定剂色甘酸钠抑制细胞脱颗粒。

4、底物显色法测定外源性刺激物作用后腹腔提取的肥大细胞及RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶释放率。

5、ELISA方法测定外源性刺激物作用后腹腔提取的肥大细胞及RBL-2H3细胞组胺含量,计算组胺释放率。

结果：1、通过改良密度梯度离心法提取纯化大鼠腹腔肥大细胞,鉴定肥大细胞纯度,甲苯胺蓝染色结果显示细胞纯度达到95%,细胞活性良好。

2、35和37培养条件下,培养2h时腹腔肥大细胞增殖活力无显著性差异,2h之后,35培养条件下的腹腔肥大细胞增殖活力明显弱于37培养条件下的腹腔肥大细胞（P<0.05）,并随时间的变化差异程度逐渐变大；腹腔肥大细胞在无外界刺激的情况下,35培养条件下的细胞p-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率明显高于37培养条件下的细胞；C48/80或IgE刺激后,35培养条件下的细胞p-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率明显升高,且升高程度显著高于37培养条件下的细胞。

3、35和37培养条件下,RBL-2H3细胞增殖活力都大于腹腔肥大细胞；无外界刺激时,35和37的腹腔肥大细胞p-氨基己糖苷酶释放率都显著高于RBL-2H3细胞,但组胺释放率有波动；C48/80刺激后,腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶及组胺释放率都升高,细胞脱颗粒程度加剧,但RBL-2H3细胞升高幅度显著低于腹腔肥大细胞；IgE刺激后,肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率升高,且显著高于RBL-2H3细胞,肥大细胞组胺释放率也有升高,但35培养条件下高于RBL-2H3细胞,37培养条件下情况相反。