小鼠胚胎成纤维细胞的培养操作步骤及应用！

一、背景

NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞是1962年Todaro G和Green H从分离的瑞士小鼠胚胎中建立的；该细胞的生长受接触性抑制，汇合状态的单层细胞密度为40000个细胞/平方厘米；检测结果显示该细胞鼠痘病毒阴性；在塑料瓶中生长较好，在某些玻璃表面上可能状态不佳；细胞生长饱和时其密度可以达到约50000 cells/cm2。

二、培养步骤

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞,完全脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于miR-342-5p在Zmpste24缺失小鼠胚胎成纤维细胞衰老及DNA损伤反应中的作用研究：

miR-342-5p在Zmpste24缺失小鼠胚胎成纤维细胞衰老中的作用目的：探讨miR-342-5p在Zmpste24-/-早老症模型小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）衰老表型中的作用机制。

方法:（1）通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测miR-342-5p在Zmpste24-/-早老模型MEFs、复制性衰老的MEFs、H2O2诱导细胞衰老的MEFs以及生理性衰老小鼠组织中的差异表达。

（2）在Zmpste24-/-MEFs中瞬时转染miR-342-5p模拟物（miR-342-5p Mimics,342M）,研究过表达miR-342-5p后对Zmpste24-/-MEFs细胞表型的影响:a.通过衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验检测细胞衰老;b.通过MTT法测定细胞生长曲线及EdU掺入实验检测细胞增殖;c.通过流式细胞术检测细胞周期以及蛋白印迹实验检测细胞周期调控蛋白。同时,在野生型（wild-type,WT）MEFs中转染miR-342-5p抑制物（miR-342-5p Inhibitor,342I）,进行平行对照实验。

（3）靶基因鉴定:首先通过microRNA（miRNA）靶基因预测软件挑选miR-342-5p潜在的候选靶基因,再将候选靶基因3′非翻译区（3′-untranslated regions,3′-UTR）包含miR-342-5p结合位点的部分序列（至少500 bp）克隆到pGL3-MCS荧光素酶报告质粒中,通过双荧光素酶实验验证miR-342-5p能否与候选靶基因3′-UTR相结合,最后采用蛋白印迹实验检测候选靶基因在Zmpste24-/-MEFs中的蛋白表达水平是否受miR-342-5p调控。

结果:（1）miR-342-5p在Zmpste24-/-早老症模型MEFs、复制性衰老的MEFs以及H2O2诱导细胞衰老的MEFs中的表达均下调。

（2）在Zmpste24-/-MEFs中过表达miR-342-5p能够降低SA-β-Gal染色细胞比例、增加细胞活力及EdU阳性细胞比例、增加细胞周期G2+M期时相比例同时上调Cdk1的蛋白表达水平。然而,在WT MEFs中抑制miR-342-5p很难观察到与Zmpste24-/-MEFs中相反的表型。

（3）候选靶基因3′-UTR部分序列成功克隆到p GL3-MCS质粒,双荧光素酶实验证实miR-342-5p在体外能直接与GAS2基因3′-UTR结合,进一步通过蛋白印迹实验证实GAS2基因在Zmpste24-/-MEFs中受miR-342-5p负调控,并发现GAS2在复制性衰老的MEFs及生理性衰老小鼠肾脏中是上调的。结论:miR-342-5p靶向抑制GAS2并促进Zmpste24-/-MEFs增殖,进而抑制Zmpste24-/-MEFs的细胞衰老表型。

探讨miR-342-5p在多柔比星诱导的NIH/3T3细胞DNA损伤反应中的作用机制。

方法:（1）用多柔比星处理NIH-3T3细胞,通过q RT-PCR及蛋白印迹实验检测miR-342-5p及DNA损伤反应相关基因的表达水平。

（2）流式细胞术检测miR-342-5p对多柔比星处理的NIH-3T3细胞周期的影响。

（3）通过miRNA靶基因预测软件挑选miR-342-5p潜在的候选靶基因,构建候选靶基因3′-UTR荧光素酶报告质粒,再通过双荧光素酶实验及蛋白印迹实验鉴定候选靶基因。

（4）蛋白印迹实验检测miR-342-5p对DNA损伤反应相关蛋白及细胞周期相关调节蛋白的影响。

结果:（1）miR-342-5p、p53及p21在多柔比星诱导的NIH/3T3细胞DNA损伤反应中上调。

（2）过表达miR-342-5p能促进NIH/3T3细胞的G1/S期时相转换并上调Cyclin A2的表达,然而抑制miR-342-5p很难对NIH/3T3细胞周期产生相反的效应。

（3）靶基因预测软件分析表明Cdkn1a是miR-342-5p的潜在靶基因,双荧光素酶实验结果表明miR-342-5p能与Cdkn1a 3′-UTR直接结合,蛋白印迹实验结果表明过表达miR-342-5p能下调Cdkn1a基因产物p21蛋白水平,同时上调p Rb与Cdk1的蛋白水平。