乳酸乳球菌的生物简介及在食品工业和代谢工程中的应用！

乳酸乳球菌( Lactococcus lactis，L. lactis)是一种原核微生物，归属于硬壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，乳球菌属，同时是乳酸菌属中的一种重要模式菌。L.lactis 细胞呈球形或卵圆形，革兰氏阳性，兼性厌氧，不产荚膜和芽孢，营养要求复杂，最适宜生长温度为30。L.lactis 广泛存在于乳制品和植物产品中，在食品工业中应用广泛，对人和动物无致病性，是被公认安全的食品级微生物( generally regards as safe，GRAS) 。

一、生物简介

乳酸乳球菌是发酵工业中常用的的发酵剂之一，特别是在发酵乳制品中。另外，乳酸乳球菌是常用的诱导表达型宿主菌之一，具有重要的研究和应用价值。乳酸乳球菌归属于硬壁菌门（Firmicutes）、杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、链球菌科（Streptococcaceae）、乳球菌属（Lactococcus）。一般认为乳酸乳球菌包括三个亚种，其中乳源的有乳酸乳球菌乳酸亚种（L.lactis subsp.lactis）和乳酸乳球菌乳脂亚种（L.lactis subsp.cremoris），还有分离自叶蝉的乳酸乳球菌霍氏亚种（L. lactis subsp.hordniae）。乳酸乳球菌主要通过表型特征（生理生化、细胞壁组成、蛋白质印记等）和基因特征（与已知菌相比较，从而得知分类位置）进行鉴定，其中遗传分析具有快速、准确、分辨率高的优点，已经成为乳酸乳球菌鉴定的主要方法。同时16S rRNA 技术已经普遍用于乳酸乳球菌的分离和鉴定。

二、菌种的培养

1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。

2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。

3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。

4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。

5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。

6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。

三、使用范围

（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。

（2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。

（3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。

四、应用

乳酸乳球菌生长快速、代谢相对简单，分解与合成代谢分开；基因组小但包含足够的生物信息，胞内外蛋白易于分离、纯化，这些优势使乳酸乳球菌在代谢调控方面具有的重大研究价值。乳酸乳球菌在乳制品中已经得到广泛的应用，它可作为发酵剂用于酸奶油、酸奶、大豆酸奶、乳饮料等乳制品的生产。它也是制备干酪常用的发酵剂，例如切达干酪、农家干酪、夸克等，乳酸乳球菌对于干酪等发酵乳制品的风味有重要影响。

1、食品工业中

由于工业化的快速发展，生活水平大幅度提高，人们开始注重食物的营养成分含量。人们不再满足于水分占百分之八十多的牛奶，而要吃牛奶的精华，于是奶油、干酪(cheese)成为人们饮食中的重要食品。干酪是在牛乳(或脱脂乳、稀奶油、酪乳等)中加入适量的乳酸菌发酵剂和凝乳酶，使乳中的蛋白质凝固，分离乳清而制得的新鲜或发酵成熟的乳制品。干酪的营养价值很高，主要成分是水、脂肪和蛋白质。干酪中的蛋白质经过发酵后，由于凝乳及微生物中蛋白酶的分解作用，形成胨、肽、氨基酸等，非常易于被人体消化吸收，干酪中蛋白质的消化率为96-98%：干酪中的钙、磷含量在所有食品中含量是最高的，而且接近人体的需要量，最易被人体消化吸收；干酪中水溶性维生素和脂溶性维生素含量也相当丰富。所以，在日常生活中增加干酪的摄入，对增强体质、保持健康有重要意义。对于乳糖不耐症人群，干酪是一种非常好的乳制品，因为牛奶中的大部分乳糖在干酪加工过程中随着乳清的排除被带走。

在西方国家，干酪是一种非常普遍的食品，应用于人们的日常饮食，消费量是相当大的。2001年欧洲人均干酪消费量为18 kg，而我国年人均消费量只有0.1 kg。究其原因，一方面是由于人们能购买到的干酪大部分是进口商品，价格较高；另一方面是由于其口味很难被国人接受，因此发展适合中国人口昧的干酪产业，对于提高我国人民的营养水平具有实际意义。

乳酸菌是干酪生产的灵魂。乳酸乳球菌是乳球菌属最重要和最典型的一个种，包含两个亚种，即乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种。一直以来，这两个亚种被人们用来作为乳制品发酵剂，前者可用于生产软干酪，后者可用于生产质地较硬的干酪。全世界范围内每年有超过一千万吨的乳酸乳球菌细胞，应用于干酪、黄油和酪乳的发酵工业中。在乳制品发酵工业中乳酸乳球菌的主要作用，除了将牛奶中的乳糖通过发酵转变成乳酸，产生风味物质双乙酰和乙醛外，在于酪成熟过程中，它胞内的肽酶和胞外的蛋白酶可以促进干酪中的蛋白质水解，从而对成熟干酪风味物质的形成具有重要作用。

切达干酪(cheddar cheese)，其名来源于十六世纪的英国原产地切达郡，是一种硬质全脂牛乳干酪。色泽白或金黄，组织细腻，口味柔和，含乳脂45%。其制作工艺如今已广传于世界许多地区，尤其是美国，由于美国产量之高和食用者之多，甚至有人将它称之为“美国干酪”。它是最基本的干酪之一，也极具“全能性”，因为在烹调过程中，从浇汁到干酪酱到烘烤，它几乎可以取代所有的干酪。然而，在切达干酪成熟过程中，由于蛋白质水解而形成的某些苦味肽会影响干酪的口感。研究表明，乳酸乳球菌乳脂亚种SK11胞内的肽酶可以降解这些苦味肽，从而提高切达干酪的可接受度，因而，乳酸乳球菌SK11被认为是生产切达干酪的一种优良菌株。

2、代谢工程

生物技术产品的安全性历来部受到人们的关注，其中，宿主菌是一个至关重要的因素。由于大肠杆菌会产生内毒素，因而如果采用传统的大肠杆菌克隆与表达外源基因，其表达产物需经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准。建立食品级基因表达系统，为有益于人类健康的外源基因表达产物在功能食品、保健品及化妆品等领域的广泛应用创造了条件。已经在一些乳酸菌菌株中建立了食品级基因表达系统，如干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌和乳酸乳球菌。其中乳酸乳球菌最有代表性，也可能是最有价值的，也是最受重视、研究得最深入的一类。乳酸乳球菌生长快速、代谢相对简单，分解与合成代谢分开，不产生任何内毒素或毒性物质；不产生孢子；不会形成包涵体；不产生任何胞外蛋白酶；单层细胞膜，利于分泌外源蛋白；基因组小，胞内外蛋白相对较少，易于纯化。这些特性使乳酸乳球菌成为代谢工程不可多得的实验对象，被誉为生产食品级代谢产物的超级“细胞加工厂”。

乳酸乳球菌中存在大量的染色体外因子(如质粒和噬菌体)，为其分子生物学研究和基因载体系统的发展提供了极好的材料。在近十多年中，随着乳酸乳球菌内源性质粒的去除和电穿孔转基因技术的建立以及乳酸乳球菌各类表达信号的分离和克隆，已建立和发展了一系列具有不同用途的乳酸乳球菌载体和受体系统。这些载体包括基本的克隆载体，启动子、终止子及分泌信号等的选择载体，各类整合载体及基因表达载体。如今，乳酸乳球菌已成为研究得最透彻的一种乳酸菌。

该诱导表达系统具有以下优点：食品级的诱导物和宿主菌，严谨性高，本底表达水平低，诱导效率高，表达产量高。该食品级基因表达系统可控制并高水平表达同源和异源基因，在食品工业及其它相关领域将具有很好的应用前景。