MLE-12小鼠肺上皮细胞的培养操作与应用！

一、背景

MLE-12小鼠肺上皮细胞 是由Kathryn A.Wikenheiser于1992年在转基因鼠体内建立，通过人表面活性蛋白C基因启动子区调控的SV40大T抗原在小鼠体内形成肺肿瘤。细胞抗原表达: HLA A11,B15,B17,Cw1,Cw3;blood type B，细胞致癌基因：myc+;myb+;ras+;fos+;p53+;sis-;abl-;ros-;src-细胞基因表达: 肺表面活性物质蛋白B和C（SP-B，SP-C），而且该细胞能够诱导癌细胞产生。

二、小鼠肺上皮细胞株培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香烟诱导肺纤维化中的调节作用研究

探讨抑制和基因敲除Shp2减轻吸烟诱导小鼠肺纤维化的作用及机制。

方法：

1、整体实验：观察Shp2特异性抑制剂PHPS1干预和肺上皮细胞Shp2基因敲除小鼠对吸烟引起的肺纤维化指标的影响。小鼠每天吸烟10支,连续10天,诱导肺纤维化模型,检测指标包括转录生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproleinase-9,MMP-9）、钙结合蛋白（Calcium binding protein,S100A4）,胶原纤维沉积以及Shp2表达。

1)收集肺泡灌洗液（BALF）,采用酶联免疫吸附（Elisa）法检测BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白表达；

2)收集肺组织,制备匀浆上清液,采用定量多聚合酶链反应（Q-PCR）法测定匀浆上清液中MMPs和TGF-β1基因的表达；

3)制作肺组织切片,采用免疫组化染色法检测小气道周围Shp2、MMP-9和S100A4表达；

4)肺组织切片,采用Masson胶原纤维染色法检测小气道周围胶原纤维沉积。

2、离体实验：观察Shp2特异性抑制剂PHPS1处理肺上皮细胞和Shp2基因沉默肺上皮细胞对CSE诱导的MMP-9和TGF-β1表达的影响,以及对信号分子的影响。香烟烟雾提取物（CSE）刺激小鼠正常肺上皮细胞MLE-12：

1)采用MTT法测定MLE-12细胞活性；

2)Western blot（WB）法检测CSE诱导p-Shp2和Shp2表达；

3)CSE刺激MLE-12细胞,Q-PCR法检测MMPs基因表达,WB法检测MMP-9蛋白表达；

4)Shp2特异性抑制剂PHPS1干预细胞后进行CSE刺激,采用Q-PCR和WB法检测Shp2对CSE诱导MMP-9基因和蛋白的影响。

四、验收细胞注意事项

1、收到小鼠肺上皮细胞MLE-12，请查看瓶子是否有破裂，培养基是否漏出，是否浑浊，如有请尽快联系。

2、收到小鼠肺上皮细胞MLE-12，如包装完好，请在显微镜下观察细胞。,由于运输过程中的问题，细胞培养瓶中的贴壁细胞有可能从瓶壁中脱落下来，显微镜下观察会出现细胞悬浮的情况，出现此状态时，请不要打开细胞培养瓶，应立即将培养瓶置于细胞培养箱里静止3-5小时左右，让细胞先稳定下，再于显微镜下观察，此时多数细胞会重新贴附于瓶壁。如细胞仍不能贴壁，请用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，如台盼蓝染色证实细胞活力正常请按悬浮细胞的方法处理。

3、收到小鼠肺上皮细胞MLE-12后，请镜下观察细胞，用恰当方式处理细胞。若悬浮的细胞较多，请离心收集细胞，接种到一个新的培养瓶中。弃掉原液，使用新鲜配制的培养基，使用进口胎牛血清。刚接到细胞，若细胞不多时血清浓度可以加到15％去培养。若细胞迏到80%左右，血清浓度还是在10％。

4、收到小鼠肺上皮细胞MLE-12时如无异常情况，请在显微镜下观察细胞密度，如为贴壁细胞，未超过80%汇合度时，将培养瓶中培养基吸出，留下5-10ML培养基继续培养：超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞，吸出培养液，1000转/分钟离心3分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。

5、将培养瓶置于37培养箱中培养，盖子微微拧松。吸出的培养基可以保存在灭菌过的瓶子里，存放于4冰箱，以备不时之需。

6、24小时后，小鼠肺上皮细胞MLE-12恢复并贴满瓶壁，即可传代。（贴壁细胞）将培养瓶里的培养基倒去，加3-5ml（以能覆盖细胞生长面为准）PBS或Hanks’液洗涤后弃去。加0.5-1ml 0.25%含EDTA的胰酶消化，消化时间以具体细胞为准，一般1-3分钟，不超过5分钟。可以放入37培养箱消化。轻轻晃动瓶壁，见细胞脱落下来，加入3-5ml培养基终止消化。用移液管轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后将溶液吸入离心管内离心，1000rpm/5min。弃上清，视细胞数量决定分瓶数，一般一传二，如细胞量多可一传三，有些细胞不易传得过稀，有些生长较快的细胞则可以多传几瓶，以具体细胞和经验为准。（悬浮细胞）用移液管轻轻吹打瓶壁，直接将溶液吸入离心管离心即可。

7、贴壁细胞，悬浮细胞。严格无菌操作。换液时，换新的细胞培养瓶和换新鲜的培养液，37，5%CO2培养。

特别提醒：原瓶中培养基不宜继续使用，请更换新鲜培养基培养。