大鼠髓过氧化物酶(MPO)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

大鼠髓过氧化物酶(MPO)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠髓过氧化物酶（MPO）的含量。

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠髓过氧化物酶（MPO）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠髓过氧化物酶（MPO）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

二、样本处理及要求

1、血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-81000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

3、细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

三、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

四、实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

五、应用

用于髓过氧化物酶在高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的意义研究：

利用食源性高脂血症大鼠模型,建立在体大鼠心肌缺血/再灌注模型,分析高脂血症是否导致大鼠心肌对缺血/再灌注损伤敏感性增加;如果是,这种敏感性的增加是否与高脂血症大鼠缺血/再灌注后缺血区心肌组织髓过氧化物酶（MPO）表达及活性异常增高相关。

方法：选用雄性Wistar大鼠,实验动物随机分为3组:正常饮食组（18只）,普通饲料饲养8周:高脂饮食组（18只）,高脂饲料饲养8周,缺血/再灌注术前连续3天腹腔注射药物溶剂（DMSO）;高脂饮食+氨苯砜组（18只）,高脂饲料饲养8周,缺血/再灌注术前连续3天腹腔注射氨苯砜（MPO清除剂,100μmol/kg,一次/天）。结扎大鼠左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时;同时在体监测各项心功能指标:利用血脂试剂盒检测血脂水平;以Evence blue和TTC复染法测定心梗面积;以TUNEL染色和caspase-3活性反应心肌细胞凋亡;分别以酶联免疫吸附法及免疫组化法检测心肌组织MPO的水平和分布。

结果：

1、食源性大鼠高脂血症动物模型的建立:高脂大鼠体重4周达277±12g、8周达423±36g,较正常饮食组大鼠明显升高。高脂大鼠4周血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平较4周前显著提高,明显高于同期普通饮食大鼠。

2、高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤敏感性增加:与正常心肌缺血/再灌注组比较,高脂组大鼠心肌缺血/再灌注后9个时间点的心功能(收缩指数CI=dp/dtmax/IP;+dp/dtmax)均有明显下降（P＜0.05）、心梗面积增大（35±29%vs.56±6%,P＜0.05）、心肌细胞凋亡指数（15±3%vs.22±2%,P＜0.05）升高以及caspase-3比活性升高（P＜0.05）。

3、高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注后缺血区MPO沉积增多、活性升高:与正常心肌缺血/再灌注组比较,高脂血症大鼠缺血区心肌组织MPO大量沉积、活性显著升高（168±13.4 U/100 mg湿组织vs.206±15.6 U/100 mg湿组织,P＜0.05）。

4、高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注后MPO活性与心肌损伤指标呈正相关:心肌梗塞面积与MPO活性呈正相关,相关系数为r=0.706,P＜0.01;凋亡指数与MPO活性呈正相关,r=0.685,P＜0.01;caspase-3活性与MPO活性呈正相关,r=0.739,P＜0.01。提示,高脂血症大鼠心肌对缺血/再灌注损伤易感性升高可能与缺血区心肌组织异常高表达的MPO相关,即MPO可能参与并加重了高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤。

5、清除MPO后,高脂血症大鼠缺血/再灌注后心肌损伤减轻,进一步阐明高脂血症大鼠缺血/再灌注后缺血区心肌组织MPO表达及活性升高可能是高脂血症大鼠心肌对缺血/再灌注损伤敏感性增加的关键因素之一。