植物细胞分裂素ELISA试剂盒的应用！

一、背景

植物细胞分裂素ELISA试剂盒定量检测植物组织，细胞及其它相关样本中细胞分裂素（Cytokinin）含量。

试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被植物细胞分裂素（Cytokinin）单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中细胞分裂素（Cytokinin）浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中细胞分裂素（Cytokinin）含量。

二、操作步骤

1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。

4、温育：37水浴锅或恒温箱温育30min。

5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。

7、温育：37水浴锅或恒温箱温育30min。

8、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

9、显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，平板混匀器混匀30s（或用手轻轻震荡混匀30s），37避光显色15min。

10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。

11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。

12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。

三、应用

用于蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）细胞分裂素应答调控及IPT基因功能鉴定研究：

分析蒺藜苜蓿对细胞分裂素及细胞分裂素抑制剂长期应答机制。通过使用两种化合物,6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine,6-BA）与洛伐他汀（lovastatin）分别行使细胞分裂素的诱导和抑制作用,对蒺藜苜蓿幼苗进行长时间处理。通过高通量测序技术,进行差异表达基因筛选和分析;并对1个细胞分裂素合成关键调控基因IPT进行了深入的功能研究,主要结果如下:1.对蒺藜苜蓿进行6-BA处理及lovastatin处理,进行高通量测序。

共构建了9个测序文库,测序和数据处理共获得了67.3Gb clean data;经过数据拼装,总共鉴定出33,782个基因和55,558条转录本,通过进一步分析发现,存在22,407条新转录本以及1,079个新基因。2.将实验样品分为两种组合:细胞分裂素处理/对照（cytokinin/control,Cyto/Ctrl）,抑制剂/对照（inhibitor/control,Inh/Ctrl）。差异表达分析发现:两种组合中分别有3,627和3,093条差异表达本（differentially expressed transcript,DET）;功能注释和植物激素数据库比对发现:两种组合中存在多条可能涉及植物激素合成、代谢及信号传导的DET。

利用RT-PCR技术,成功克隆蒺藜苜蓿IPT基因,该基因的编码区全长为900-bp,编码300个氨基酸;利用大肠杆菌表达体系,成功表达IPT重组蛋白;通过免疫小白鼠,成功制备IPT蛋白质多克隆抗体。

构建IPT基因植物表达载体,通过农杆菌介导转基因技术,获得转基因紫花苜蓿;筛选高水平表达转基因植株,表型分析结果显示:转基因植物分枝数增多,植物衰老推迟;ELISA检测发现:转基因植物中的细胞分裂素水平远远高于未转基因植物;在持续干旱条件下,转基因植物对干旱抵抗能力明显高于未转基因植物。

对蒺藜苜蓿进行细胞分裂素、细胞分裂素抑制剂长期处理,进行了转录组测序及分析研究,筛选了一批可能涉及蒺藜苜蓿细胞分裂素应答关键调控基因,初步阐述了蒺藜苜蓿对细胞分裂素调控及响应机制;并对一个潜在的参与蒺藜苜蓿细胞分裂素合成调控基因IPT进行了克隆及转基因功能鉴定,证实:该基因参与细胞分裂素生物合成,高水平表达该基因提高植物对干旱抵抗能力,能够延缓植物的衰老。