大鼠脑皮层神经元细胞培养实验的方法与步骤！

大鼠脑皮层神经元细胞培养可以：

（1）获得大鼠脑皮层神经元细胞；

（2）用于神经元细胞定向分化研究；

（3）用于神经元细胞凋亡研究。

一、实验方法

机械性划割培养，酶消化法

二、实验原理

SD胎鼠脑皮层神经元体外培养7 d，微量移液器塑料滴头于培养孔内机械性划割培养之神经元，依划割程度不同分为轻、中、重3组，对照组除不进行机械性划割，其余处理同损伤组，伤后不同时间点（10，30min ， 1，3，6，12，24 h）检测细胞存活率及培养液上清乳酸脱氢酶(LDH)含量。

三、实验材料    

SD大鼠

试剂、试剂盒    

硼酸硼砂缓冲液 胰酶-EDTA 消化液 D-Hanks’

四、仪器、耗材    

眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱

五、实验步骤

1、孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的 D-Hanks’平衡盐液中。

2、在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。

3、随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10S)的离心管内终止消化液作用5 min。

4、用滴管吸出组织转移到装有预冷的 DMEM＋10S 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤 2～3 次。

5、将所收集的上清经200 目筛网过滤。

6、过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20S)并吹打 成单细胞悬液。

7、细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2  种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。培养48 h 后换液并 加入Ara-C使其终浓度为 1×10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量换液。以后每隔 3 天半量换液一次。

六、注意事项    

1、上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动：如消化时可以直接用0.125-0.25%的胰酶消化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶进行消化，有人还直接进行吹打，都可行。

2、上面虽然时大鼠皮层神经元，但是同样适用于小鼠，但是应该选择孕13 d 左右的小鼠。

3、神经元是一种比较难培养的细胞，因此在接种时细胞的密度一定要够。

4、在玻片上培养神经元时，一定要注意玻片的来源和处理方法，这个非常重要，对神经细胞的影响是很大的。如果您现在在玻片上培养的神经元生长情况还不错的话，那么您在以后的培养中最好还是用同 一来源(厂家)的玻片。

5、如果有B27 和neurobasal 培养基，那么就方便了(不用加 AraC):

(1)把细胞悬液用(DMEM＋20S)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成 2% B27 的 neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。

(2)把细胞悬液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培养基悬浮接种。

(3)可以用新生1 d 内的胎鼠皮层直接培养。