人椎间盘髓核细胞的处理方法与操作步骤及主要应用！

一、产品信息

平台编号：Bio-73560

规格：1×10Cells/T25培养瓶

细胞信息：原代细胞

细胞名称：人椎间盘髓核细胞

培养条件：原代细胞取组织现分

组织来源：椎间盘组织

用途：研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、细胞简介

人椎间盘髓核细胞分离椎间盘组织；椎间盘是位于脊柱两椎体之间，分为中央部的髓核，富于弹性的胶状物质；周围部的纤维环，由多层纤维软骨环按同心圆排列。上下有软骨板，是透明软骨复盖于椎体上，下面骺环中间的骨面。上下的软骨板与纤维环一起将髓核密封起来。纤维环由胶原纤维束的纤维软骨构成，位于髓核的四周。纤维环的纤维束相互斜行交叉重叠，使纤维环成为坚实的组织，能承受较大的弯曲和扭转负荷。髓核，是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。婴幼儿时期的髓核含水量为80%-90%，即使到了老年，其含水量也在70%上下。髓核在出生时体积大而松散，位于椎间盘的中央，至成年时位置移至椎间盘的中后部；在成年以前构成髓核的主要物质是大量蛋白多糖复合体、胶原纤维和纤维软骨，随着年龄的增长，髓核中的蛋白多糖解聚增多，水分逐渐减少，胶原增粗并逐渐被纤维软骨所替代。

三、方法简介

实验室分离的人椎间盘髓核细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法并结合软骨细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10cells/瓶。

四、质量检测

实验室分离的人椎间盘髓核细胞经型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

五、培养信息

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每3-4天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 梭形、多角形

传代特性 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液 0.25%胰蛋白酶

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

人椎间盘髓核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

六、主要应用

人椎间盘髓核细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法并结合软骨细胞专用培养基培养筛选制备而来。人椎间盘髓核细胞主要用于科学研究。

七、操作步骤

1、将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片，待细胞长至80%时取出爬片。

2、用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3、0.5% Triton X-100（PBS配制）室温孵育爬片20min，使细胞通透。

4、3% H2O2滴加爬片上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15min（一般用甲醇或蒸馏水稀释30%过氧化氢），PBS冲洗3次，每次3min。

5、封闭血清室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min。

6、细胞特异性一抗孵育：按照抗体说明书稀释比例稀释好一抗，滴加在爬片上，于4°C湿盒中孵育一夜，PBS冲洗3次，每次3min。

7、二抗孵育：选与一抗对应的二抗，按比例稀释后滴加在爬片上，37°C湿盒中孵育30min，PBS冲洗3次，每次3min。

8、将爬片周围水渍吸干，爬片上滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，当出现棕黄色或棕褐色的阳性信号时用蒸馏水冲洗终止显色。

9、复染：用Harris苏木素复染30s~1min，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用蒸馏水（或PBS）水洗返蓝。

10、封片：将中性树胶滴在爬片一侧，再用盖玻片盖上，先放平盖玻片一侧再轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好的爬片平放置于通风厨中晾干。

11、镜检观察。

八、细胞处理方法

以下细胞处理方法及细胞说明书仅供参考,产品仅用于科研具体操作还需要根据到货时细胞密度,细胞生长状态等具体情况,酌情处理,如需要更详细技术指导,请及时电话或邮件联系。

（一）贴壁细胞

1、客户接收到细胞,用75%的酒精消毒(建议配制75%酒精的水是灭菌过的)培养瓶外部。

2、肉眼观察细胞培养基颜色,显微镜观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收到时的培养瓶拍一张照片,显微镜拍收到时的细胞100X ,200X 各一张)。

3、显微镜观察细胞,当细胞融汇至80%左右(可以传代的情况下),细胞应该在37度培养箱预温1-2h后再做处理。如未达到细胞传代密度,培养瓶应预留一部分培养基继续培养。

4、严格无菌操作,打开细胞培养瓶。

5、将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出(严禁直接倾倒),放入另一无菌容器中(建议换新的培养基培养细胞)。

6、用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面,加入适量的0.05%胰酶-EDTA消化细胞,显微镜下观察细胞变圆,轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落,加入终止液终止。

7、1000rpm,5min离心,重悬细胞。换新的细胞培养瓶,37,5%CO2  培养。

（二）悬浮细胞

1、接收到细胞,用75%的酒精消毒(建议配制75%酒精的水是灭菌过的)培养瓶外部。

2、肉眼观察细胞培养基颜色,显微镜观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收到时的培养瓶拍一张照片,显微镜拍收到时的细胞100X ,200X 各一张)。

3、严格无菌操作,打开细胞培养瓶。

4、将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出(严禁直接倾倒)。

5、1000rpm,5min离心,重悬细胞。换新的细胞培养瓶,37,5%CO2 培养。