含铁牛奶培养基的背景与使用方法及应用！

一、背景

含铁牛奶培养基用于饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的测定，配方(每升):全脂奶粉：199g；硫酸亚铁：1g。

原理：产气荚膜梭菌能发酵乳糖,凝固酪蛋白并大量产气,呈“暴烈发酵”现象。

二、使用方法

1、称取含铁牛奶培养基200g,加入50~60温水溶解,分装试管,每管10mL,115高压灭菌10min,灭菌后,快速冷却。本培养基必须新鲜配制。

2、取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛奶培养基,46水浴培养5h。

3、观察是否有“暴烈发酵”现象。

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。

产气荚膜梭菌是人类气性坏疽的主要病原菌。1892年,美国病理学家W.H.韦尔奇等自一尸体分出本菌,因而又称韦氏梭菌。菌体较大，大小为(0.9～1.3)×(3.0～9.0)微米,无鞭毛，有荚膜。芽孢椭圆形,位于次级端。厌氧不严格。菌落直径2～5毫米，血琼脂平板上有溶血圈。糖发酵能力强，产酸产气。本菌的特征之一是在牛乳培养基中呈暴烈发酵现象。形成的毒性物质有12种，可损伤细胞膜、血管内皮细胞并使糖类分解，导致细胞坏死、组织水肿、充气等病变。根据产生毒素种类和致病性的不同,本菌有A、B、C、D、E、F6个型。有些菌株产生肠毒素，可引起食物中毒。DNA中的G+C克分子含量为24～27%。本菌广泛存在于土壤、人和动物的肠道以及动物和人类的粪便中，会散发臭味。

三、应用

用于牛A型产气荚膜梭菌分离鉴定与疫苗菌株筛选研究：

对取自内蒙古、山西、四川等地奶牛场22头猝死牛肠、肝、肺、心等135份病料,划线10%绵羊鲜血琼脂平板初步分离培养,出现双溶血环菌落平板42个,从中选取106个单菌落（菌株）进行产气荚膜梭菌分型PCR检测,检出103个菌株为A型产气荚膜梭菌,3个菌株为C型产气荚膜梭菌。对103个菌株扩繁培养,经菌液毒素毒力（小鼠最小致死量）测定,获得毒力≤0.1m L菌株30株,后经进一步筛选,获得1株毒力（小鼠最小致死量）≤0.025m L、纯粹检验合格的菌株,命名为CNM0708株。对筛选CNM0708菌株进一步进行培养特性、生化鉴定、血清型鉴定、分子生物学、毒力传代稳定性、动物致病性、免疫原性等鉴定。

结果表明,该菌株为革兰氏阳性粗大杆菌,两端钝圆,培养菌液毒素的小鼠MLD≤0.025m L。血平板厌氧培养24h,出现半透明、灰白色的圆形菌落,菌落周围有明显α、β双溶血环。石蕊牛乳培养基培养出现“爆烈发酵”现象;生化鉴定结果符合产气荚膜梭菌生化特性;对培养菌液提取毒素进行血清中和试验,符合A型产气荚膜梭菌血清型特性。筛选CNM0708菌株经16S r DNA基因测序结果及α毒素基因核苷酸序列与Genbank上公布的参考菌株比对,同源性分别达99.70%、98.1%～100%。CNM0708菌株培养菌液对牛,及提取毒素对牛、兔、鼠有致病性,均可引起接种动物死亡。

将筛选CNM0708菌株制备种子批,扩量培养菌液,经灭活脱毒、离心与上清液浓缩后制备免疫原性试验抗原,免疫实验动物兔,一免后21日采血,测定每0.1m L血清中和效价达1;对靶动物牛二次免疫后14d,免疫牛5头与对照牛2头分别颈静脉攻击致死量A型产气荚膜梭菌毒素。

对照牛2/2死亡,免疫牛5/5保护。本试验分离、筛选CNM0708菌株为A型产气荚膜梭菌,免疫原性良好,可作为疫苗研发用菌株。