小鼠高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

小鼠高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)ELISA试剂盒用于检测血清，血浆，尿液，组织匀浆，细胞上清液，脑脊液，灌洗液，粪便等样本中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。

二、实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定样品指标水平。样品包括血清血浆尿液脑脊液细胞固体组织等，用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中浓度，或者与CUTOFF值相比较，从而判定标本阴阳性。

三、样品收集、处理及保存方法

1、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2、血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3、细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

四、操作步骤

1、标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。

2、加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3、温育：用封板膜封板后置37温育30分钟。

4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7、温育：操作同3。

8、洗涤：操作同5。

9、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37避光显色10分钟.

10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

五、应用

用于急性冠脉综合征患者高密度脂蛋白胆固醇水平与炎性指标间的关系研究：

探讨急性冠脉综合征（Acute Coronary Syndrome,ACS）患者高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）水平与炎性指标之间的关系。

方法：回顾性分析诊断为ACS的291例患者的临床资料,所有入选患者均在住院期间行冠状动脉造影检查以明确罪犯血管。入院24小时内抽取静脉血测定白细胞计数（White blood count,WBC）、中性粒细胞计数和淋巴细胞计数并计算中性粒细胞与淋巴细胞比值（Neutrohil-to-Lymphocyte Ratio,NLR）、超敏C反应蛋白（High sensitivity C-reactive protein,Hs-CRP）和HDL-C。根据HDL-C值分为两组:HDL-C低水平组（<40mg/d L）共111例,HDL-C正常水平组（≥40mg/d L）共180例。采用单因素分析及Spearman相关性分析分析ACS、急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）和ST段抬高型急性冠脉综合征（Non-ST-segment elevation acute coronary syndrome,NSTE-ACS）患者的HDL-C水平与炎性指标之间的关系。

结果：1、在ACS患者中,不同HDL-C水平组患者的WBC（t=-3.216,P=0.002）、NLR（t=-4.105,P<0.001）和Hs-CRP（t=-4.806,P<0.001）差异有统计学意义,Spearman相关性分析表明HDL-C与WBC（r=-0.196,P=0.008）、NLR（r=-0.193,P=0.001）、Hs-CRP（r=-0.242,P<0.001）均呈显著负相关;

2、在STEMI患者中,不同HDL-C水平组患者的WBC（t=-4.550,P<0.001）、NLR（t=-4.762,P<0.001）和Hs-CRP（t=-5.623,P<0.001）差异有统计学意义,Spearman相关性分析表明HDL-C与WBC（r=-0.302,P=0.002）、NLR（r=-0.372,P<0.001）、Hs-CRP（r=-0.378,P<0.001）均呈显著负相关;

3、在NSTE-ACS患者中,不同HDL-C水平组患者的WBC（t=-2.313,P=0.022）、NLR（t=-4.105,P<0.001）和Hs-CRP（t=-3.669,P<0.001）差异有统计学意义,Spearman相关性分析表明HDL-C与WBC（r=-0.155,P=0.011）、NLR（r=-0.187,P=0.011）、Hs-CRP（r=-0.236,P=0.001）均呈负相关。