人肌酸激酶(CK)ELISA 试剂盒的应用！

一、背景

人肌酸激酶(CK)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人肌酸激酶（CK）的含量。

二、实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人肌酸激酶（CK）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人肌酸激酶（CK）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

三、样本处理及要求

1、血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-81000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

3、细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

四、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

五、实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

六、应用

用于母体血清中CK、AFP联合β-hCG对产前胎盘植入的预测价值研究：

1、探讨母体血清中肌酸激酶（Creatine kinase,CK）、甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）及β-人绒毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin,β-hCG）单项指标对产前胎盘植入（Placenta increta,PIA）的预测价值;

2、探讨母体血清中CK、AFP及β-hCG三项指标联合预测胎盘植入的预测价值;

3、计算出母体血清中CK、AFP及β-hCG预测胎盘植入的临界值（Cut off value,cut off值）。

方法：收集存在发生胎盘植入高危因素且以剖宫产终止妊娠的孕妇102例。根据术中所见及术后病理组织学诊断（子宫平滑肌中可见绒毛）分为胎盘植入组及非胎盘植入组,胎盘植入组包括胎盘粘连28例,胎盘植入20例,穿透性胎盘植入2例,共50例,即实验组;将具有相同或相似高危因素而未发生胎盘植入的孕妇52例为非胎盘植入组,即对照组,同时随机选择以剖宫产终止妊娠而无高危因素的正常孕妇60例为空白对照组。

选择SPSS25.0进行数据统计,计量数据采用（`X±s）表示,多组间比较采用单因素方差分析,绘制受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC曲线）,并计算曲线下面积（Area under curve,AUC）,得出CK、AFP及β-hCG单独预测胎盘植入的灵敏度、特异度、诊断符合率及三者联合预测胎盘植入的灵敏度、特异度、诊断符合率,利用约登指数计算出CK、AFP及β-hCG预测胎盘植入的cut off值。当P<0.05时,差异具有统计学意义。

高危因素：剖宫产手术史、高龄产妇、多次生产史、多次刮宫及人流等宫腔内操作史。

结果：实验组孕妇血清中CK、AFP及β-hCG水平显著高于对照组及空白对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;血清CK对胎盘植入的敏感度为42.67%,特异度52.68%,诊断符合率69.72%,血清AFP对胎盘植入的敏感度为65.78%,特异度60.24%,诊断符合率71.68%,血清β-hCG对胎盘植入的敏感度为67.38%,特异度69.46%,诊断符合率73.09%,三者联合对预测胎盘植入的灵敏度分别为:79.04%,特异度分别为:81.57%,诊断符合率80.67%;实验组孕妇血清中CK、AFP及β-hCG预测胎盘植入的临界值分别是128.09U/ml、270.67U/ml及28709.5U/L。

结论：1、实验组母体血清中CK、AFP及β-hCG的水平均明显高于对照组及空白对照组；

2、母体血清中CK、AFP及β-hCG对胎盘植入具有一定的预测价值,尤其三者联合筛查对产前胎盘植入的预测价值明显升高；

3、实验组母体血清中CK、AFP及β-hCG预测胎盘植入的临界值分别是128.09U/ml、270.67U/ml及28709.5U/L。