SP6RNA聚合酶RNA酶抑制剂(SAMPLEKIT)的应用！

一、背景

SP6RNA聚合酶RNA酶抑制剂(SAMPLEKIT)通过抑制RNA聚合酶来阻断、抑制或者干扰核酸的代谢过程，最终抑制转录的一类化合物。

SP6 RNA Polymerase，即SP6 RNA聚合酶，是一种高度特异识别SP6启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。SP6 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA SP6启动子下游NTP的掺入，合成与SP6启动子下游的模板DNA互补的RNA。

特点：SP6 RNA Polymerase可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于SP6启动子有高度的特异性。

用途：用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定(RNase protection assay)，反义RNA合成，作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析，siRNA、miRNA等小RNA。

来源：由大肠杆菌表达，表达基因为嗜菌体SP6 RNA Polymerase基因。

活性定义：3760分钟内，催化1nmol AMP掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。

失活或抑制：70加热10分钟可使SP6 RNA Polymerase失活。加入适量EDTA也可以使SP6 RNA Polymerase失活。螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制SP6 RNA Polymerase的活性。

二、应用

用于基于原子力显微镜力谱的大肠杆菌启动子与RNA聚合酶相互作用分析研究：

首先以噬菌体T7转录系统为模式研究对象,对T7启动子与T7 RNA聚合酶（RNAp）交互作用开展基于原子力显微镜（Atomic Force Microscope,AFM）力谱（force spectroscopy）分析的分子交互作用研究,建立了启动子与RNAp体外交互作用分析平台,并通过体内报告基因的表达量等分析,验证体外交互作用分析启动子强度的有效性。基于此平台,以大肠杆菌的启动子为研究对象,通过定点改造,得到在启动子核心区域关键位点存在突变的一系列启动子,分析这些启动子与大肠杆菌RNAp之间的交互作用,初步验证了大肠杆菌启动子序列与活性的关联。

本文主要研究成果如下：

（1）建立了可用于AFM力谱分析的基底及探针的修饰方法。选择表面平整的硅基底进行化学改性及T7 RNAp固定,通过AFM对基底表面扫描成像,选择了较优的基质烷基化修饰策略,并优化了T7 RNAp硅基底的固定化浓度,由此得到的基质在固定蛋白后,蛋白分布均匀并密度适中,为较优的固定化策略;同时,启动子通过其3’端修饰的巯基与探针金镀层的表面形成Au-s配位键固定于AFM探针表面。通过与多组对照实验,证实该固定化体系降低了表面的非特异性结合概率,提高AFM力谱检测的灵敏度和有效性。

（2）建立了基于AFM力谱技术的启动子与RNAp体外交互作用分析方法。通过采集大量AFM力-距离曲线,结合统计学分析,得到了T7启动子与T7 RNAp间的交互作用力为304.2±12.7 pN。对T7启动子的-10及-11位点进行突变,测得突变启动子与T7RNAp间的交互作用力、解离距离及结合概率。通过与对照实验对比,验证通过上述分析得到的交互作用为T7启动子与RNAp之间的特异性结合。利用启动子探针质粒,通过报告基因—氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol Acetyl transferase,CAT）的酶活表征得到的启动子强度的结果与体外AFM力谱分析一致,初步验证了启动子体外交互作用分析的有效性。

（3）基于AFM力谱分析的大肠杆菌启动子筛选。确定了大肠杆菌RNAp基底固定化的最优浓度为100 U·m L-1。基于前部分研究建立的AFM力谱分析启动子强度的方法,选取了大肠杆菌的Ls1强启动子为研究对象,并以它的序列作为原始序列,设计一系列在关键位点（-10区和-35区）有突变的启动子序列。考察了Ls1等启动子与RNAp间的交互作用力,结合概率,筛选了不同强度的启动子。并通过测定CAT酶活验证了上述结果。

（4）大肠杆菌启动子序列特征与启动子/RNAp交互作用力间的关联分析。Ls1启动子是在-10及-35区具有保守序列的强启动子,其体外交互作用力为331.1±5.1 pN。通过删除Ls1启动子的-10区定向改造得到Ls2启动子,对其进行体外交互作用分析发现,与Ls1启动子相比,所测得的作用力的概率分布未体现正态分布特征,无特异性交互作用力。在-10区保守序列不变的前提下,对-35区进行突变,得到Ls1-T2（1个碱基差异）,Ls1-T1（1个碱基差异）以及Ls1-35（3个碱基差异）三个启动子,测得的体外交互作用力分别为293.3±5.5 pN,271.9±6.7 pN,243.5±5.2 pN。与Ls1启动子比较发现,关键位点越保守交互作用力越大。综上结果,从启动子与RNAp结合力的角度验证了启动子-10区及-35区的保守区域对启动子活性的显著影响。