氯霉素试剂盒的操作流程与应用！

一、背景

氯霉素试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产组织、畜禽组织、肝脏、蛋类、蜂蜜、牛奶及饲料等样品中的氯霉素药物（Chloramphenicol，Cap），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的氯霉素药物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗氯霉素药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含氯霉素药物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氯霉素药物的残留量。

氯霉素属抑菌性广谱抗生素，因而被广泛运用于对畜禽疾病控制和治疗中。但由于氯霉素对人的造血系统有严重不良反应，能引起人的再生障碍性贫血，粒细胞缺乏症等疾病，因此欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。氯霉素检测试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，操作时间仅需1.5小时，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

二、操作流程

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于动物源性食品中氯霉素快速检测的ELISA方法研究：

对氯霉素人工抗原的合成、抗体的纯化以及ELISA检测方法的建立和优化等进行了研究。采用活性酯法和重氮化法,将半抗原氯霉素与小牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联,经紫外光谱、红外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定证明半抗原与载体蛋白偶联成功。运用合成的免疫原（Hap-BSA）多次免疫动物,采集抗血清,制备出氯霉素多克隆抗体,经ELISA法测定抗体效价可达到1:1000000。采用饱和硫酸铵分级沉淀法对采集的抗血清进行初级分离,后利用自制的免疫亲和层析柱对IgG粗品进一步进行亲和层析纯化,可获得高纯度高特异性的兔抗氯霉素抗体。

通过比较不同的酶标记方法,选用混合酸酐法合成酶标半抗原,并用ELISA法确定了偶联后HRP的活性。通过对包被缓冲液、洗涤次数、包被温度、时间、减少非特异性吸附的方法等的筛选,优化了固相抗体-酶标抗原直接竞争酶联免疫分析方法。确定以0.05mol/L pH9.6的CBS缓冲液作为包被酶标板的抗体稀释缓冲液,以0.01mol/L pH7.4 PBS溶液作为酶标抗原的稀释液,以1.0%OVA的PBS溶液作为封闭液,固相包被条件为372h最佳。利用优化后的分析条件和酶标半抗原采用直接竞争ELISA法进行抗体亲和性和特异性研究。

通过方阵试验及筛选得到优化浓度组合为:抗体28.30μg/ml、酶标半抗原5.36μg/ml。氯霉素在0.2-64ng/ml浓度范围内,抑制率与浓度呈线性关系,回归方程为y=-14.84310gx+56.692,R~2=0.9965,IC50=2.82ng/ml,IC10=0.451ng/ml。与其他类抗生素无明显的交叉反应。

实验中确定了对鸡肉,牛奶和新鲜虾肉中氯霉素的提取方法,据此构建的ELISA试剂盒可用于样品中氯霉素的快速检测。样品的添加回收率范围在72.6%-113.6%之间,变异系数在4.26%-17.75%之间。试剂盒性能测试结果表明,其准确性和重现性较好,储存期试验表明试剂盒在4下可保存4个月。可用于虾肉,鸡肉,牛奶等样品中氯霉素残留的批量快速,廉价的检测。