细菌总 RNA 快速抽提试剂盒的应用！

一、背景

细菌总RNA快速抽提试剂盒可从细菌细胞中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。因为细菌RNA半衰期很短，RNA很容易发生降解。针对这一难题，本试剂盒采用溶菌酶与裂解液Buffer Rlysis-B共同作用，快速裂解样品，再通过氯仿抽提、无水乙醇沉淀等步骤，可获得浓度高、完整性好的RNA。

适合于从各种来源的细菌（革兰氏阳性或阴性菌等）培养液中快速提取RNA。使用本试剂盒，从1 ml对数生长期的细菌菌液中提取5~15μg总RNA。提取的总RNA纯度高，没有蛋白和其他杂质的污染，可直接用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern blot、Dot blot、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等多种下游实验。

二、操作步骤

1、取1 ml对数生长期的细菌，8,000 rpm 4°C离心1 min，彻底弃掉培养基，加100µl溶菌酶，振荡混匀。

2、立即加入900µl Buffer Rlysis-B震荡混匀，室温放置3 min。

3、向裂解样品中加入200µl氯仿，充分混匀。12,000 rpm 4°C离心5 min，取上清。

4、向上清液中加入1/3体积无水乙醇，混匀，室温放置3 min，12,000 rpm 4°C离心5 min，小心倒掉上清。

5、用700µl的75%乙醇（请用DEPC-treated ddH2O配制）洗涤沉淀，12,000 rpm 4°C离心3 min,小心倒掉上清。

6、重复步骤5一次。

7、室温倒置10 min，尽可能使离心管中残留的乙醇彻底挥发。加入30-50µl的DEPC-treated ddH2O溶解沉淀，立即使用或-70°C长期保存。

三、应用

用于嗜盐四联球菌总RNA提取方法的优化研究：

以嗜盐四联球菌为实验材料，大肠杆菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为对照菌，采用改良前后的Trizol法，RNAisoplus法、Qiagen试剂盒法以及Triton X-100法分别提取上述3株菌的总RNA。

用琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪检测总RNA的提取质量，通过反转录PCR（Reverse transcriptionPCR，RT-PCR）及实时荧光定量PCR（Real Time quantitative PCR，RT-qPCR）对嗜盐四联球菌的总RNA提取质量进行评估，分析各种细菌总RNA提取方法的优劣，以确定嗜盐四联球菌总RNA的最优提取方法。

利用总RNA的最优提取方法（Triton X-100法），提取嗜盐四联球菌总RNA，通过RT-qPCR分析不同盐浓度胁迫条件对嗜盐四联球菌分子伴侣蛋白DnaK mRNA的转录水平影响。

建立了适宜嗜盐四联球菌总RNA提取的最优方法，为革兰氏阳性菌总RNA的提取提供重要的理论依据和实验基础；初步探索了DnaK在嗜盐四联球菌抗逆系统中的作用。

研究成果如下：

（1）改良后的RNAiso plus法和Trizol法，通过加热更彻底的裂解细菌细胞，并且使得获得的RNA不含有16S和23S rRNA。有效地改善了嗜盐四联球菌的RNA质量。

（2）利用无水乙醇替代75%乙醇，可更有效地去除RNA溶液中的盐离子，降低RNA样品中的杂质污染，排除盐离子对后续酶反应的抑制作用。

（3）本研究证明，Triton X-100法尤其适合嗜盐四联球菌等难破壁革兰氏阳性菌的总RNA提取，并具有快速、经济、高效等优点。此法能有效保持RNA的完整性，同时可去除16S和23S rRNA，为某些对16S和23S rRNA敏感的酶反应提供高质量RNA模板。

（4）利用RT-qPCR检测在盐胁迫下DnaK基因的表达水平，结果表明，该基因在盐胁迫下的表达有所提高，说明DnaK基因在嗜盐四联球菌对抗盐胁迫等逆境中具有重要的作用。