小鼠胶质瘤细胞的操作流程与应用！

一、背景

小鼠胶质瘤细胞含有编码命名为p185的185000道尔顿抗原的转化基因。p185蛋白质与胶质母细胞瘤和成神经细胞瘤癌基因的存在密切相关。小鼠胶质瘤细胞癌基因与erb-B癌基因同源，并且p185与表皮生长因子受体在血清学上相似。

二、操作流程

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于HCMV IE86对转基因荷瘤小鼠胶质瘤细胞凋亡及p53表达的影响研究：

p53蛋白可调节各种基因的转录,包括涉及细胞周期调控,DNA修复和程序性细胞死亡。p53蛋白可以活化p21蛋白,并将p21蛋白充当介质以抑制细胞分化和增殖。因此推测:IE86蛋白可通过p53信号通路对恶性神经胶质瘤细胞凋亡产生影响。然而,由于HCMV存在物种特异性,之前对其IE86蛋白的研究只局限于细胞及分子水平。

通过动物水平,在体内探究IE86对基因修饰荷胶质瘤小鼠p53表达水平及恶性胶质瘤细胞凋亡情况的影响。

方法：首先,通过PCR技术对基因修饰小鼠IE86表达情况进行鉴定。依据鉴定结果将小鼠分为四组,每组各12只,分别是IE86阳性肿瘤组织组、IE86阴性肿瘤组织组、IE86阳性脑组织组、IE86阴性脑组织组。然后,将小鼠神经胶质瘤UL261细胞传代培养以制备细胞密度为3×10 7个/mL的单细胞悬液。

在IE86阳性肿瘤组织组、IE86阴性肿瘤组织组小鼠的右侧腋下接种0.1mL已制备好的单细胞悬液,另外两组在相同部位接种0.1mLPBS。接种胶质瘤细胞后,连续观察IE86对肿瘤生长及小鼠存活情况的影响,待荷瘤成功后,处死小鼠后分别取出肿瘤组织和脑组织。统计分析IE86对肿瘤生长状况的影响,应用HE染色来观察肿瘤形态结构特点。

利用实时定量PCR的技术检测IE86和p53mRNA表达水平变化。免疫组织化学方法检测p53受体的表达水平。分别用Western blot和免疫组织化学方法分析了p21受体的表达水平情况。TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况。

结果：PCR结果显示,成功构建了IE86基因修饰小鼠模型并且荷瘤成功;实时定量PCR与免疫组织化学结果显示,与IE86阴性组相比IE86阳性组p53表达水平上升（P<0.05）,同时Western blot和免疫组织化学方法显示,IE86阳性组p21表达水平下降（P<0.05）;TUNEL检测结果显示,IE86阳性组细胞抗凋亡能力增强（P<0.05）。以上结果表明,在基因修饰的小鼠中IE86持续表达但p53转录活性的指示标志p21下调,且IE86可提高恶性胶质瘤细胞抗凋亡能力。

结论：本研究中IE86基因修饰荷胶质瘤小鼠模型的成功建立,克服了HCMV物种特异性的局限,首次实现从动物水平上探究IE86对恶性胶质瘤细胞凋亡的影响,这有利于阐明IE86蛋白在维持病毒感染中的作用,为恶性神经胶质瘤细胞凋亡相关分子机制提供理论基础。