伪原薯蓣皂苷含量试剂盒的背景与应用！

一、背景

伪原薯蓣皂苷含量试剂盒采用高效液相色谱(HPLC)和液质联用(LC-MS)技术，可高效、精准的检测伪原薯蓣皂苷的含量变化。

伪原薯蓣皂苷(Pseudoprotodioscin,PPD)是一种甾体皂苷成分，在地奥心血康中含量较高，具有多种药理活性如抗肿瘤、抗血小板凝集、调节免疫、抗炎等，是反映药材和制剂质量的一个重要指标。

高效液相色谱(HPLC)，是在经典液相色谱法的基础上，于20世纪60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀。因为较小的填充颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。

使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛地应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。

二、应用

用于伪原薯蓣皂苷通过调控miR-182-5P-FoxO1抑制子宫内膜癌的机制研究：

探究伪原薯蓣皂苷（pseudoprotodioscin,PPD）对人子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和自噬的影响。并探讨mi R-182-5P是否通过靶向Fox O1参与伪原薯蓣皂苷抗肿瘤的作用,以初步探索其作用机制。

方法：PPD对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

1、采用MTT实验检测不同浓度、不同作用时间下,PPD处理子宫内膜癌细胞后的生长情况,筛选实验所需的药物浓度。

2、应用划痕实验检测80μg/m L PPD作用于子宫内膜癌细胞24 h、48 h和72 h之后,对细胞迁移的影响。

3、应用Transwell实验检测80μg/m L PPD作用子宫内膜癌细胞24 h后,细胞侵袭情况。

PPD对子宫内膜癌细胞凋亡和自噬的影响

1、采用Annexin V-FITC/PI双染实验检测PPD对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。实验分组:Ctrl组和PPD处理组。

2、使用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位,实验分为3组:Ctrl组加入新鲜培基,处理组分别加入40μg/m L、80μg/m L的PPD孵育48 h,TMRM孵育30 min后,去除染色液进行拍照。

3、转染Ad Plus-m Cherry-GFP-LC3B腺病毒,利用激光共聚焦显微镜测定PPD对子宫内膜癌细胞自噬的影响。实验分组:Ctrl组和PPD处理组。

4、Western Blot检测凋亡和自噬相关蛋白的表达。

5、流式细胞术检测抑制细胞自噬后PPD对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。实验分为4组,分别为Ctrl、3-MA、PPD和PPD+3-MA,处理组3-MA 0.5 m M、PPD 80μg/m L和PPD 80μg/m L+3-MA 0.5 m M分别作用于HEC-1A和Ishikawa细胞48 h,FCM检测细胞凋亡率。

PPD调控mi R-182-5P和Fox O1对子宫内膜癌细胞生物功能学的影响

1、采用RT-q PCR检测PPD对子宫内膜癌细胞相关mi RNAs的影响。

2、利用RT-q PCR检测mi R-182-5P的转染效率。

3、通过脂质体介导瞬时转染mi R-182-5p mimics上调mi R-182-5p表达,结合PPD处理子宫内膜癌细胞后,利用MTT、划痕实验、transwell和流式细胞术分析mi R-182-5p过表达对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。

4、通过Target Scan Human预测mi R-182-5P的靶蛋白。再运用WB验证mi R-182-5P和Fox O1是否存在直接靶向关系以及凋亡和自噬蛋白表达情况。同时,在实验中使用Fox O1的抑制剂AS1842856,进一步研究Fox O1对凋亡和自噬的影响。

结果：PPD对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

1、PPD能够显著抑制子宫内膜癌细胞增殖,与Ctrl组相比,随PPD浓度增加抑制作用随之增强（P<0.01）,且呈浓度依赖性增加。MTT实验测得子宫内膜癌细胞的IC50值80μg/m L,将作为之后部分实验用药浓度。

2、PPD能抑制细胞迁移,与Ctrl组相比,随PPD作用时间延长迁移率降低。

3、PPD能抑制细胞侵袭,与Ctrl组相比,随PPD作用时间延长细胞侵袭数目显著降低。