运动发酵单胞菌的特性与用途及培养方法！

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是发酵单胞菌属的一个种，由于其具有很强的运动性而得名。

一、菌株发现

有关Z. mobilis的记载，最早是1928年Lindner关于从墨西哥的龙舌兰酒中分离的一种微生物的报道。后来人们从苹果酒、棕榈树榨取液、甘蔗汁以及啤酒中均发现有Z. mobilis的存在。从此，人们对这种细菌的形态、培养方式、代谢途径及分类等基本特征和在工业医疗领域的应用价值进行了大量的研究。

运动发酵单胞菌属革兰氏阴性细菌，微好氧生长。它是唯一一种通过ED代谢途径将葡萄糖和果糖转化为乙醇的细菌。因其丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因能够高效表达，乙醇发酵能力非常突出。同时Z. mobilis生长的营养需求相对简单。这些优点使得Z. mobilis在工业化生产领域具有广阔的应用前景。

二、菌株特性

运动发酵单胞菌是一种革兰氏阴性菌，大多呈直杆状，尾端呈圆形或卵圆形，有1～4根鞭毛，宽1～1.5 µm，长2～6 µm，常成对存在，但很少集结成短链状。兼性厌氧条件生长，在25～31 ，在无氧条件下生长最佳，有氧条件下也可生存，在60 、5 min可灭活。Z. mobilis高度耐酸，能在pH3.5～7.5之间生长。高度耐受酒精，在乙醇浓度5.5%条件下可以无影响生长，浓度达到7.7%时则无法生长。高度耐受葡萄糖，在含有20%浓度葡萄糖环境中可以正常生长，当浓度达到40%时只有11～89%的菌株可以存在。只要含有D-葡萄糖或果糖，就很容易在液体培养基中生长。但是生长的必需条件就是含有维生素H和泛酸盐，且在培养基中混入氨基酸就可以使细菌生长的很好，但却没有一种氨基酸是生长所必需的。细菌在微需氧条件下，菌落直径在2d时可以长到0.3 mm，7～8 d时长到3～5 mm，呈圆形，规则，有完整边界，凸起状，不透明，灰白色。

三、菌种的用途

运动发酵单胞菌存在广泛。在坏掉的啤酒、苹果酒、梨酒、发酵的龙舌汁、棕榈汁、含糖的果汁及蜂蜜中均可以发现，尤其在热带国家的一些发酵植物果汁中很常见。

在代谢方面，Z. mobilis只能发酵葡萄糖、果糖和蔗糖。在1950年代早期，Gibbs和DeMoss就发现，发酵单胞菌在厌氧条件下以Enter-Doudoroff途径代谢糖而在生物化学界扬名。这让人们非常惊讶，因为发酵单胞菌是第一个(至今仍为数不多)厌氧条件下应用严格需氧菌代谢糖的途径的细菌。Seo等报道了Z. mobilis ZM4的全基因组序列后，提出造成这种现象的原因是因为细菌中缺少Embden-Meyerhof-Parnas代谢途径的关键酶6-磷酸果糖激酶和三磷酸循环中的两个关键酶2-酮戊二酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶，所以只能够采用ED途径代谢葡萄糖产生乙醇，这一过程中的关键酶是丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶。

发酵单胞菌只把很少量的一部分葡萄糖同化作为构造细胞用。约98%的葡萄糖发酵生成乙醇，只有2%作为碳源。有氧呼吸时，会把酒精变成醋酸。

运动发酵单胞菌最大的不足处是其所能利用的碳源受到限制，无法充分利用木质纤维素水解糖类。因此，从20世纪80年代开始，人们便开始利用基因工程的方法改造Z. mobilis，扩大其碳源范围，经过20多年的努力，取得了很大的成功。同时，人们还尝试利用Z. mobilis强大的ED代谢途径来生产其它产品，如丙氨酸、β-胡萝卜素等。

四、菌种的培养

1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。

2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。

3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备 菌种制备。

4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。

5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。

6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。

五、使用范围

（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。

（2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。

（3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。

六、保藏方法

1、传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6冰箱内保存。

2、液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3、载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4、寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5、冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20-30，-50-80）、干冰酒精快速冻结（约-70）和液氮（-196）等保藏法。

6、冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。