凋亡DNA LADDER快速提取试剂盒的应用！

一、背景

凋亡DNA LADDER快速提取试剂盒选择性从组织和细胞中分离提取凋亡DNA ladder，通过选择性分离基因组DNA与凋亡DNA ladder，最大限度的减少了基因组DNA对凋亡DNA ladder的观察干扰，因此显著提高了检测敏感度。反应可在微量离心管进行，2.5小时完成，快速方便；无需有机抽提，检测灵敏度J高，可从约2000个凋亡细胞中检测到DNA ladder。推荐起始细胞量为5-10x105个，但投入的细胞量可在1x105~5 x106之间变化。

原则是总细胞中应含有至少约1-2x104个凋亡细胞。多于2x104个凋亡细胞通常可获得十分清晰的凋亡DNA ladder。本试剂盒也可用于从组织中提取凋亡DNA ladder。但与培养细胞相比，整体动物组织凋亡细胞出现的时间、部位、程度等规律性差往往造成难以准确取材，可能显著影响实验结果。

凋亡(apoptosis)或程序性死亡的细胞一个形态学的显著特点是染色体DNA以核小体为单位（185bp）规律断裂形成长度约为n x 185bp(n=1,2,3,4……）的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳显示为阶梯状凋亡DNA Ladder，是凋亡细胞最直观的特征。

细胞凋亡(Apoptosis)是生物体发育等生命过程中普遍存在的、由基因决定的细胞主动有序的死亡方式。当细胞遇到内、外环境因子刺激时，启动基因调控的自杀保护措施，去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。在这一过程中，细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除，这是一种由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，包含一系列信号事件组成的通路。

细胞凋亡失调与多种疾病有关，例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌症等。

细胞凋亡通过特征性的形态学和生物化学变化而区别于坏死(Necrosis)，包括细胞皱缩、细胞核皱缩、核膜核仁破碎等等。在正常活细胞中，磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)位于细胞膜的近细胞质面。而在凋亡细胞中，PS从质膜的内部外翻到细胞表面即细胞膜外侧，从而使PS暴露于细胞外部。在白细胞的凋亡过程中，白细胞表面的PS标记可以被巨噬细胞识别，从而最终被巨噬细胞吞噬。

二、应用

用于ZNF268a在DNA损伤应答过程中的调节功能和机制初探研究：

用DNA损伤试剂CPT作为刺激手段诱导细胞发生DNA损伤。通过confocol实验发现,DNA损伤前后ZNF268a在细胞中的定位几乎不发生变化。而且,通过western blot实验检测了DNA损伤修复相关蛋白p-ATM和γ-H2AX的表达,然而ZNF268a蛋白的特异性表达缺失几乎不影响这些蛋白的表达。这表明ZNF268a对DNA损伤修复无明显作用。

而DNA损伤应答机制会进一步引发细胞周期阻滞、自噬、凋亡等过程。因此,我们通过MTT、克隆形成实验检测细胞增殖可知,ZNF268a蛋白的缺失能够抑制细胞增殖。经流式细胞术和关键蛋白的检测后,结果表明ZNF268a的敲除对细胞周期和自噬均没有显著调控作用,但ZNF268a的敲除能促进CPT、ETO、TNFα/CHX三种方式诱导的细胞凋亡。

这些结果表明,ZNF268a在细胞生命过程中扮演着重要角色。更进一步地,为了探究ZNF268a调控内源性DNA片段引起炎症和细胞死亡的功能,用两种sg RNA介导的基因组敲除技术构建了ZNF268a敲除的U2OS细胞系。然后用DNA损伤药物CPT或ETO处理细胞导致促炎症因子TNFα、IL-6、IL-8的表达在m RNA水平上调,但是ZNF268a的敲除会抑制促炎症因子的产生。我们通过荧光素酶报告基因表达质粒检测ETO处理后NF-κB的活性,发现ZNF268a蛋白的缺失抑制了ETO激活的NF-κB信号。

这些结果表明,ZNF268a蛋白的特异性表达缺失能够降低ETO诱导引起的NF-κB通路的活性。综上所述,本研究发现ZNF268a的敲除能抑制细胞增殖,而促进内源性DNA片段诱导的细胞凋亡,同时,能够一定程度上抑制DNA损伤激活的NF-κB通路活性。这些结果不仅丰富了人们对ZNF268a蛋白的认知,而且提示我们内源性与外源性刺激引起的炎症应答可能存在交叉,有助于我们进一步理解内源性与外源性应答的异同。