EHA105农杆菌感受态细胞的应用及操作方法！

一、背景

EHA105农杆菌感受态细胞由EHA101菌株改造而来(Hood et al.,1993)，为农杆菌C58型背景，核基因中含有利福平抗性基因(Rif)。此菌株还携带一种自身转运功能丧失的质粒(disarmed Ti plasmid)。EHA105菌株含有胭脂碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA),该质粒含有vir基因(vir基因是TDNA插入植物基因组所必需的元件，pEHA105(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可辅助植物双元表达载体的T-DNA的转移）。pEHA105(pTiBo542DT-DNA)质粒还含有Str抗性基因，赋予EHA105菌株链霉素抗性。EHA105农杆菌适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。EHA105电转感受态特别适用于大质粒的转化，经pCAMBIA2301M质粒检测转化效率大于105 cfu/μg DNA。

二、操作方法

1、电极间距为0.1cm的电转杯（Gene Pulser®/MicroPulser™electroporation cuvettes）插入碎冰中，压实冰面，冰中静置5分钟，使电转杯充分降温。（电转杯重复使用方法：每次用完后，用大量的自来水冲洗干净去掉菌液和DNA，用蒸馏水洗3遍，将其泡在75%乙醇中30分钟，取出杯子，沥干液体，放在超净台中，使乙醇充分挥发，盖上盖子放干燥地方备用。）

2、取-70保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1μg质粒DNA（洗脱或溶解质粒的溶液中离子不能太高，或用双蒸水稀释），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，在超净台中用无菌吸头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

3、启动电转仪，设置电击参数：C=25μF，PC=200ohm，V=2400V（此参数为BioRad公司推荐，依据不同电转仪设置针对农杆菌合适的电击参数）。用纸巾擦掉电转杯外部的水分，将电转杯快速放入电转槽中进行电击步骤。电击完成后，将电转杯快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到原来保留的感受态空管中，28，150-200 rpm振荡培养2-3小时。

4、6000rpm离心一分钟收菌，留取200μl左右上清轻轻吹打重悬菌块，取100μl的菌液涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28培养箱培养2-3天（当平板只含有50μg/ml kan时，28培养48h即可；平板中同时加入50μg/ml kan，20μg/ml rif时，需28培养60h；如果使用的平板含有50μg/ml rif则需要28培养72-90h）。组成BC307-01EHA105 Electrocompetent cells 20×50μlpCAMBIA2301(1μg/μl)1支

三、应用

用于不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物研究：

在已初步建立的农杆菌EHA105介导银耳转基因方法的基础上,以银耳潮霉素敏感菌株Tr21-01为出发菌株,通过冻融法将携带有潮霉素磷酸转移酶（Hph）基因为遗传标记及人胰岛素基因（BAC）为目的基因的质粒pBHg-BCA导入根癌农杆菌GV3101,LBA4404和AGL-1中,并进一步介导转化银耳进行研究。

实验结果发现：AGL-1具有较高的转化率;GV3101转化率较低,且假阳性较高;LBA4404无抗性菌落长出。此结果表明不同的农杆菌侵染银耳芽孢能力具有差异性,且对受体侵染具有一定的特异性。

以农杆菌EHA105为参照菌株,对农杆菌AGL-1介导转化银耳进行研究。基于农杆菌介导转基因受诸多因素的影响,本实验从农杆菌与银耳芽孢共培养时间、银耳芽孢浓度、农杆菌浓度、诱导剂乙酰丁香酮（AS）的浓度、转化菌株阳性比率等方面进行优化。

其转化条件优化结果为：AGL-1菌液OD值为0.4～0.5,AS诱导培养浓度为250μg/mL、共培养浓度为150μg/mL,银耳芽孢浓度为108/mL,共培养72h转化率最高,可达500个/108,且阳性菌落为89%;EHA105菌液OD值为0.4～0.5,AS诱导培养浓度为200μg/mL,共培养浓度为200μg/mL,银耳芽孢浓度为108/mL,共培养48h转化率最高,可达380个/108,且阳性菌落为83%。通过比较发现AGL-1比EHA105有更高的转化率。

通过上述转基因方法,筛选到大量转化子,随机挑选26株转化子通过ITS,Hph基因及BCA基因进行DNA水平验证,同时随机选取6株进行Hph基因和BCA基因的cDNA水平验证。

实验结果表明：选取的转化子都为阳性菌株,并且检测到Hph基因和BCA基因的mRNA。通过对60株转基因菌株利用ELISA法对BCA目的基因进行初步检测,结果表明部分菌株可以检测到表达目的BCA基因的表达产物。

进一步分析检测得到的有目的BCA基因表达菌株发现,其潮霉素抗性很高,大部分潮霉素抗性达350μg/mL。此结果说明目BCA基因的表达与抗性基因Hph表达存在一定关系。