小鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方法与步骤！

一、产品信息

平台编号：Bio-108776

规格：1×10Cells/T25培养瓶

细胞信息：原代细胞

细胞名称：小鼠骨髓间充质干细胞

用途：研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、细胞详述

骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织。在骨髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。

三、细胞特性

1)组织来源于实验动物的正常骨髓血组织。

2)细胞鉴定：CD44免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：长梭形细胞，不规则细胞，贴壁培养。

四、产品的运输和保存

视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80的条件下保存1个月。

2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

五、产品使用

1)本产品仅能用于科研

2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核

3)本产品未通过用于活体诊断的审核

六、工具与原料

1、6-8周龄小鼠

2、DMEM，双抗，70%乙醇，台盼蓝，胎牛血清，PBS，0.25%TE

3、解剖用镊子和剪刀，注射器，9cm培养皿，碎冰,血细胞计数板

七、方法与步骤

1、颈椎脱位杀死小鼠（Balb / c，6-8周龄）；用70％乙醇浸泡；将后肢皮毛剥除；沿着脊髓切开，从身体的躯干解剖后肢，小心不要损伤股骨；将后肢储存在DMEM+1% P/S中等待进一步解剖。

2、进一步解剖后肢。通过切开膝关节来切开每个后肢；从胫骨和股骨中去除肌肉和结缔组织；将骨干刮干净；将四肢储存在DMEM+1% P/S中。

3、超净台操作（提前照紫外，注意无菌操作）：切断骨髓腔末端下方的胫骨和股骨的末端；将装有完整培养基的10 ml注射器上的27号针头插入通过移除生长板暴露的海绵状骨中，用1ml完全培养基将骨髓塞从骨头切开的末端冲洗出来，收集在冰上的10ml管中（关键步骤在骨髓细胞制备过程中，必须进行强力清洗）。

4、通过70mm过滤网过滤细胞悬液，以去除任何骨针或肌肉和细胞团块； 通过台盼蓝排除法测定细胞的产量和活力，并在血细胞计数器上计数（一只小鼠7×107）。

5、在95mm培养皿中培养BM细胞，在1ml完全培养基中，密度为25×106个/mL细胞（基于步骤4中获得的细胞计数）；3h后更换新的完全培养基。

6、再培养8小时后，用1.5ml新鲜的完全培养基替换培养基；此后，每8小时重复该步骤，直至72小时的初始培养。

7、用PBS洗涤贴壁细胞（第0代），每3-4天加入新鲜培养基；初始贴壁纺锤形细胞第3天显示为单个细胞； 在4-8天内，培养物变得更加清晰，并在2周内达到65-70％的影响；（ 在这个阶段，培养物通常表现出两个特征：首先，平板可能含有不同大小不同的成纤维细胞集落; 第二种可以包含散布在细胞集落之间或之上的非常少量的造血细胞）。

8、在开始培养2周后，用PBS洗涤细胞，用0.5ml 0.25％ TE/ 1mM EDTA在室温下孵育2min；加入1.5ml完全培养基中和胰蛋白酶，将所有消化下来的细胞在T25培养瓶中培养( 传代的时间和温度非常重要, 如果时间和温度分别高于2分钟和25，非MSCs和mMSCs将从塑料培养皿中浮起）。

9、后续每3天更换培养基（每次更换6 ml培养基）；一般7天内达到传代密度。