17-Α-羟化酶(17-Α-OH)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

17-Α-羟化酶(17-Α-OH)ELISA试剂盒用于测定血清，血浆及相关液体等样本中人17-Α-羟化酶(17-Α-OH)的含量。

实验原理：人17-α-羟化酶(17-α-OH)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人17-α-羟化酶(17-α-OH)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人17-α-羟化酶(17-α-OH)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

二、人17-α-羟化酶(17-α-OH)ELISA试剂盒标本要求

1、血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-81000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

三、人17-α-羟化酶(17-α-OH)ELISA试剂盒操作流程

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

四、应用

用于非经典型21-羟化酶缺陷症与多囊卵巢综合征的鉴别诊断分析研究：

非经典型21-羟化酶缺陷症（NC21-OHD）与具有高雄激素的多囊卵巢综合征（PCOS）临床表现相似,实验室及影像学检查重叠且二者均缺乏特异性的诊断标准,所以NC21-OHD在临床上极易被误诊为PCOS,导致长期进行无效治疗。本研究拟通过对比临床已确诊的31例NC21-OHD和29例具有高雄激素的PCOS患者的临床资料,探索二者的鉴别诊断方法,为两种疾病的早期精准诊断和治疗提供理论依据。

对象与方法：

1、对象选择31例女性NC21-OHD患者以及同期就诊于我科随机抽取的29例具有高雄激素的PCOS患者。

2、方法：2.1收集患者血清电解质、血脂、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、泌乳素（PRL）、性激素结合球蛋白（SHBG）、肾素活性（PRA）、醛固酮（ALD）、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素释放试验的检测结果,并计算体重指数（BMI）、LH/FSH、游离睾酮指数（FAI）、稳态模型的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、血糖曲线下面积（GAUC）、胰岛素曲线下面积（IAUC）。收集1日法中剂量地塞米松抑制试验（DAST）前后血清促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（COR）、17-羟孕酮（17-OHP）、孕酮（P）、总睾酮（TT）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）、雄烯二酮（AD）的检测结果,计算各项指标下降的百分比,作为其被抑制率。对于FSH、LH、P、TT、PRL、DHEAS、AD、17-OHP等指标的检测均在患者自然月经周期的第2-4日或35天以上未来月经任意一天抽取晨8:00空腹外周静脉血。收集所有研究对象的子宫附件超声、肝脏超声及肾上腺增强CT的检查结果以及曾进行基因检测的25例NC21-OHD女性患者的CYP21A2基因的突变情况。

2.2对比NC21-OHD组与PCOS组患者的临床表现、影像学特征、激素水平及其相关代谢指标,并采用ROC曲线分析各指标对于此两种疾病的鉴别诊断价值。2.3采用SPSS 22.0和MedCalc v19.0.7统计软件对数据进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果：

1、PCOS组患者身高和卵巢多囊样变（PCO）发生率显著高于NC21-OHD组（P<0.05）,NC21-OHD组患者肾上腺增生发生率显著高于PCOS组（P<0.05）;两组患者年龄、BMI、收缩压、舒张压、血钾、血钠以及月经紊乱、不孕、多毛的发生率均无显著性差异（P>0.05）。NC21-OHD组患者阴蒂轻度肥大者12例（38.71%）,PCOS组患者此特征不明显。

2、NC21-OHD组患者ACTH、17-OHP、AD、P、TT、PRL水平显著高于PCOS组（P<0.05）;PCOS组患者LH、LH/FSH水平显著高于NC21-OHD组（P<0.05）;对上述指标进行ROC曲线分析,曲线下面积（AUC）分别为0.673、0.959、0.848、0.917、0.786、0.686、0.843、0.867,通过对AUC进行比较,发现17-OHP与P、LH/FSH三者之间的AUC无显著性差异（P>0.05）,但其显著大于其余指标的AUC（P<0.05）。根据Youden指数计算出17-OHP、P以及LH/FSH的最佳切点值分别为3.34ng/ml（敏感度89.7%,特异度93.1%）、0.64ng/ml（敏感度90.0%,特异度75.9%）和1.25（敏感度85.7%,特异度85.7%）。对NC21-OHD组患者的17-OHP与P进行相关性分析发现二者呈显著的正相关关系（P<0.05）,而LH/FSH与17-OHP、P均无明显的相关性（P>0.05）。

3、对比两组患者1日法中剂量DAST,NC21-OHD组患者17-OHP、AD、TT和P抑制率显著高于PCOS组（P<0.05）,对上述指标进行ROC曲线分析,AUC分别为0.996、0.972、0.960和0.873。对17-OHP、AD、TT和P抑制率的AUC进行比较发现差异均无统计学意义（P>0.05）,根据Youden指数计算出其抑制率最佳切点值分别为73.5%（敏感度95.2%,特异度100.0%）、55.5%（敏感度100.0%,特异度88.9%）、61.4%（敏感度84.2%,特异度100.0%）、54.2%（敏感度85.0%,特异度80.0%）。