小鼠Β半乳糖苷酶(ΒGAL)ELISA KIT的应用！

一、背景

小鼠Β半乳糖苷酶(ΒGAL)ELISA KIT是利用双抗体夹心ELISA法定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中Β半乳糖苷酶(ΒGAL）的含量。

实验原理：预先包被的抗体和检测相抗体都是亲和纯化多克隆抗体。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的Β半乳糖苷酶(ΒGAL)呈正相关。

GAL是细胞溶酶体中的水解酶，在肾近曲小管上皮细胞中含量较高。尿中GAL活性可反映肾实质，特别是肾小管的早期损伤，与尿中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)一同测定作尿酶谱分析，有助于病程观察和预后评价。在遗传学领域中对人类β-半乳糖苷酶缺陷病的诊断(包括产前诊断)和基础研究也是重要的指征。

二、操作步骤

1、从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4、随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于表达β-半乳糖苷酶的galB16肿瘤模型的建立及其在抗肿瘤免疫研究中的初步应用：

建立一个以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型—galB16肿瘤模型。并且在模型成功建立后，运用β-半乳糖苷酶表达载体作为DNA疫苗，在galB16肿瘤模型上进行了初步的抗肿瘤免疫方法的研究。

研究工作可以分为几个部分：构建携带β-半乳糖苷酶编码基因的真核表达载体p3gal；p3gal载体稳定转染B16小鼠黑色素瘤细胞，获得稳定表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞；建立表达β-半乳糖苷酶的小鼠galB16肿瘤模型；用免疫方法抑制galB16肿瘤生长的动物实验。

首先通过Hind和BamHI限制性内切酶双酶切从Promega公司的质粒pSV-β-Galactosidase control vector上切下完整的β-半乳糖苷酶编码基因，插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点的Hind和BamHI酶切位点之间，得到重组载体p3gal。经过酶切和测序鉴定后，按照Qiagen质粒纯化试剂盒提供的方法抽提p3gal，以Qiagen质粒纯化柱纯化后，瞬时转染小鼠黑色素瘤B16细胞，48小时后X-Gal细胞染色结果显示有细胞呈蓝色，即表达β-半乳糖苷酶。从功能上验证了构建的p3gal载体含有能够在真核细胞中表达的β-半乳糖苷酶编码基因。

进一步用纯化的p3gal表达载体稳定转染B16细胞。通过G418压力筛选来得到稳定转染了外源基因的单细胞克隆。然后对得到的各个单细胞克隆进行X—Gal细胞染色鉴定，表达β-半乳糖苷酶的细胞将呈蓝色，很容易在光学显微镜下区别出来。

通过这种方法，获得了能够表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞株。表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞株继续在G418压力下培养，到足够的细胞量后接种到C57小鼠背部皮下，成功地建立了肿瘤模型。取肿瘤抽提基因组DNA用β-半乳糖苷酶基因引物从基因水平上进行PCR扩增鉴定，鉴定结果表明所建立的肿瘤基因组中含有β-半乳糖苷酶编码基因片断。然后取肿瘤组织做10μm冰冻切片，对切片进行X—Gal组织染色鉴定，结果肿瘤组织切片可以染成蓝色。

从功能水平上证明所建立的肿瘤模型表达β-半乳糖苷酶。至此，以β-半乳糖苷酶为肿瘤标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型—galB16肿瘤模型成功地建立。成功建立表达p一半乳糖昔酶的小鼠ga1B16肿瘤模型后，后续工作就是在该模型上，针对p一半乳糖普酶设计免疫疫苗的抗肿瘤免疫方法的研究。