人肝癌细胞的培养方法与应用！

一、背景

人肝癌细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGF的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。

二、细胞培养方法

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

将冻存管在37温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

将冻存管放入程序降温盒，放入-80冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

三、应用

用于蜂毒素诱导保护性自噬对人肝癌细胞生长的影响研究：

以人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2为研究对象,并建立了肝癌细胞荷瘤鼠模型,在体、内外研究蜂毒素对人肝癌细胞自噬的诱导作用,并分别通过激活和抑制自噬观察蜂毒素对人肝癌细胞增殖、凋亡、细胞死亡的作用,明确自噬在蜂毒素诱导人肝癌细胞死亡中的作用和地位。通过对自噬、凋亡相关通路蛋白的检测,探讨蜂毒素诱导人肝癌细胞死亡可能的相关作用机制,为以后蜂毒素的抗肿瘤研究提供实验基础和思路。

蜂毒素对人肝癌细胞增殖抑制及诱导自噬作用：

1、MTT法检测不同浓度Mel对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞分别作用不同时间的增殖抑制率;通过倒置相差显微镜观察不同浓度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞24h细胞形态变化;通过Annexin V-FIFC/PI双染法检测不同浓度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞24h细胞凋亡情况;通过台盼蓝染色法检测检测不同浓度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞24h细胞的死亡情况。

2、Western Blot分别检测不同浓度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞24h及5μg/mL Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞不同时间后,LC3/、Beclin 1、p62蛋白的表达;透射电镜检测5μg/mL Mel作用人肝癌HepG2细胞不同时间（0h、24h）后细胞自噬体的形成情况;免疫荧光检测5μg/mL Mel对人肝癌HepG2细胞干预24 h后Beclin 1的表达;对人肝癌HepG2细胞进行pEGFP-LC3质粒转染,激光共聚焦检测Mel对人肝癌HepG2细胞LC3的表达。

自噬机制在蜂毒素诱导人肝癌细胞死亡中的作用：

1、MTT法、Annexin V-FIFC/PI双染法、台盼蓝染色法检测自噬抑制剂、自噬激活剂单独和联合5μg/mL Mel对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞分别作用24 h后的增殖抑制率、细胞凋亡及细胞死亡情况。

2、自噬抑制剂单独和联合5μg/mL Mel对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞干预后,Western Blot检测Beclin 1复合物及凋亡通路相关蛋白的表达情况。