牛甘氨酸受体Β(GLRΒ)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

牛甘氨酸受体Β(GLRΒ)ELISA试剂盒用于体外检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中甘氨酸受体Β(GLRΒ)含量或活性。

试剂盒原理：已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

二、样品收集、处理及保存方法

1）血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2）血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3）细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4）组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液

5）保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70保存，避免反复冷冻。

三、操作步骤

(1)使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

(2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

(3)加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的*标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。

(4)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

(5)每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。

(6)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

(7)每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。

(8)取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

(9) 在450nm波长处测定各孔的OD值。

四、结果判断与分析

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的待测物质标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

五、应用

用于腺苷对甘氨酸受体α1ins亚基的调节作用研究：

甘氨酸受体（Glycine receptors,GlyRs）是由α（α1-α4）亚基和β亚基组成的五聚体蛋白。在成年动物的脊髓背角中,包含α1亚基的甘氨酸受体介导的抑制性突触传递,在痛觉调控中发挥着重要作用。α1亚基存在一种异构体,即α1ins。资料显示:在炎性疼痛发生后,腺苷能够显著增强甘氨酸受体的功能,缓解动物的疼痛反应,然而到目前为止,腺苷调节甘氨酸受体的机制尚不明确。本研究旨在探索腺苷对甘氨酸受体α1ins亚基的调控作用。

方法：本研究足底注射完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）建立炎性疼痛模型,通过行为学实验测定动物的疼痛阈值,研究腺苷对炎性疼痛诱发的痛觉超敏和痛觉过敏的影响;通过免疫组织化学和免疫细胞化学方法,确定α1ins亚基在脊髓神经元中的分布;通过膜片钳电生理学记录方法,研究腺苷对甘氨酸受体电流的影响;通过免疫印迹分析,研究腺苷对α1ins亚基第380位丝氨酸残基（Ser380）和细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2）磷酸化水平的影响。

结果：（1）腺苷能够升高炎性小鼠的机械性缩足阈值（Paw Withdrawal Thresholds,PWTs）和热缩足反应潜伏期（Paw Withdrawal Latencies,PWLs）;

（2）腺苷通过突触后机制,升高甘氨酸受体的电流幅值;

（3）α1ins亚基是A1型腺苷受体（A1Rs）的调控底物,激动A1Rs会选择性升高α1ins亚基的电流幅值,而对α1亚基的电流幅值无明显影响;

（4）α1ins亚基分布于脊髓背角浅层神经元,且定位于抑制性突触后膜;

（5）G蛋白的βγ亚基（Gβγ）是A1Rs调控α1ins亚基的关键信号分子,抑制Gβγ会消除腺苷对α1ins亚基电流幅值的升高作用,而抑制cAMP-依赖性蛋白激酶（PKA）对α1ins亚基的电流幅值无明显影响;

（6）腺苷通过抑制ERK1/2的活性,逆转炎性损伤诱发的α1ins亚基Ser380磷酸化水平的升高。

结论：腺苷增强甘氨酸受体α1ins亚基的突触传递功能,抑制炎性疼痛症状。