大鼠谷胱甘肽硫转移酶O1(GSTO1)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

大鼠谷胱甘肽硫转移酶O1(GSTO1)ELISA试剂盒适用于体外定量检测大鼠血清、血浆或其它相关生物液体中天然和重组硫转移酶O1（GSTO1）的浓度。

试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗大鼠GSTO1抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的大鼠GSTO1与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗大鼠GSTO1抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。

抗大鼠GSTO1抗体与结合在包被抗体上的大鼠GSTO1结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，大鼠GSTO1浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中大鼠GSTO1的浓度。

二、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于含硒谷胱甘肽硫转移酶的真核表达及抗氧化作用研究：

用基因工程的方法构建了Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）分泌型真核细胞表达载体，并通过HEK293T细胞成功表达，经过活性检测，发现Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）表现出较高的GPX活性。并且，在细胞水平上对Se-hGSTZ1-1的抗氧化作用进行了初步探索。

主要开展了以下工作：1、含硒谷胱甘肽硫转移酶的表达与纯化利用本课题组已构建好的含有hGST Z1-1基因的硒蛋白真核表达载体和快速定点突变法，将与底物GSH结合部位中编码15位Ser的基因替换成由UGA编码的催化官能团Sec，在其N-末端含有六个组氨酸标签以方便检测及纯化。将含有突变后的靶基因的质粒克隆扩增，获得突变质粒。再将质粒转染HEK293T细胞并在细胞培养液中添加无机硒以促进重组硒蛋白的表达。应用Ni2+螯合亲和层析（IMAC）纯化可溶性表达的重组含硒蛋白Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）。应用western blot实验鉴定表达和纯化的重组含硒蛋白。

2、对重组硒蛋白的GPX活性及动力学研究通过对重组含硒蛋白Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）的GPX活力检测发现，Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）的GPX活性为2266±308U/μmol。通过动力学分析发现Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）对GSH的亲和力较高。通过同源建模的方法对Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）及Se-hGSTZ1-1的结构进行对比，探索性地分析了Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）与天然GPX活力差异以及Seleno-hGSTZ1-1（Ser15Sec）与Se-hGSTZ1-1活力差异的原因。

3、在细胞水平研究含硒谷胱甘肽硫转移酶的抗氧化作用利用H2O2损伤大鼠心肌细胞建立制造氧化应激模型，分别采用预给药和造模后给药两种给药方式对Se-hGSTZ1-1的抗氧化作用进行研究。

通过运用丙二醛（MDA）测定试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、SOD检测试剂盒及流式细胞仪检测发现，含硒谷胱甘肽硫转移酶能增加心肌细胞存活率,减少脂质过氧化产物MDA的生成,降低由细胞膜完整性被破坏而引起的LDH泄漏,降低细胞内SOD含量。

通过western blot对细胞PPAR-γ、NF-κB、bcl-2和bax含量的检测发现，Se-hGSTZ1-1能逆转H2O2引起的心肌细胞PPAR-γ和bcl-2的低表达及NF-κB和bax的高表达，表明，Se-hGSTZ1-1在对抗H2O2损伤大鼠心肌细胞的过程中，能调节PPAR-γ、NF-kB、bcl-2和bax的表达，并使其趋于正常表达状态。