小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA KIT的应用！

一、背景

小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA KIT采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠SOD单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的SOD与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠SOD，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，SOD浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中SOD浓度。

二、准备试剂与收集血样

1、收集标本：血清、血浆（肝素抗凝）、细胞培养上清液、尿液、唾液等尽早检测，2-8保存48小时；更长时间须冷冻（-20或-70）保存，避免反复冻融。

2、标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成4000n g/ml的溶液。设标准管8管，每管加入标本稀释液20 0ul。在第一管中加入4000n g/ml的标准品溶液2 00ul混匀后用加样器吸出2 00ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出2 00ul弃去。第八管为空白对照。

3、10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4、洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

三、检测程序

1、加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37120分钟。

2、洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3、每孔中加入第一抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置376 0分钟。

4、洗板：同前。

5、每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置373 0分钟。

6、洗板：同前。

7、每孔加入底物工作液100ul，置37暗处反应15分钟。

8、每孔加入100ul终止液混匀。

9、30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

四、结果计算与判断

1、所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2、以标准品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3、根据样品OD值在该曲线图上查出相应SOD含量即可。

五、应用

用于调补心肾方对轻度认知损害小鼠学习记忆能力和脑组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平的影响研究：

观察调补心肾方对D-半乳糖所致轻度认知损害小鼠学习记忆能力及脑组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性含量的影响,从而探讨调补心肾方治疗轻度认知损害的疗效机理。

方法：小鼠禁食16小时后分别放入食物迷宫中,选择总在寻找跑动,并于20-40分钟内找到食物的小鼠为实验鼠。留取15只做正常对照组,剩下小鼠每日一次皮下注射10%D-半乳糖100mg/kg,连续8周。验证造模成功后将模型小鼠随机分为5组,分别包括模型对照组、阳性药物组（复方脑蛋白水解物片）300mg/kg及调补心肾方高中低13.0、6.5、3.25g生药/kg剂量组。正常对照组及模型对照组每日灌胃10ml/kg蒸馏水,其余各组每日灌胃给予相应治疗药物1次,连续60日,末次给药后将小鼠再次放入食物迷宫中,连续5天观察并记录小鼠在食物迷宫中行走方向错误次数和寻找到食物所用时间。

然后处死小鼠,立即取全脑,用考马斯亮蓝显色法测定脑组织蛋白含量,用比色法测定小鼠脑组织中MDA含量和SOD活性。

结果：阳性药物组与调补心肾方高、中、低剂量组均能改善模型小鼠的学习记忆能力,其中调补心肾方高剂量组在减少小鼠寻找食物错误次数方面优于阳性药物对照组,调补心肾方中剂量组在缩短小鼠寻找食物所用时间方面优于阳性药物组。阳性药物组与调补心肾方高、中、低剂量组均能降低模型小鼠脑组织中MDA含量,提高SOD活性,其中调补心肾方中剂量组优于阳性药物组。

结论：调补心肾方能够改善D-半乳糖所致的认知功能损害小鼠的学习记忆能力,其机制可能与其提高脑组织抗氧化能力,减轻氧化应激损伤有关,主要表现在降低脑组织中MDA含量,提高SOD活性。