SVEC4-10(小鼠淋巴结内皮细胞)的应用！

一、背景

SVEC4-10(小鼠淋巴结内皮细胞)是来源于成年小鼠腋窝淋巴结的上皮细胞样贴壁细胞系，不含真菌、细菌、HIV、支原体、衣原体等污染，生长培养基：DMEM＋10S＋1%P/S。

二、SVEC4-10(小鼠淋巴结内皮细胞)复苏操作：

1）将培养基在37水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0）。注意冻存管管口不能没入水中，BIU-87(人膀胱癌细胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

三、应用

用于黑色素瘤外泌体促进淋巴管新生的作用及机制研究：

通过对黑色素瘤外泌体中的mircoRNA进行测序分析,结合生物信息学筛选出可能促进淋巴管新生的关键分子,并初步探索可能的作用机制。

方法：

1、使用外泌体抽提试剂盒分离提取鼠黑色素瘤B16F10细胞外泌体（标记为B16-Exo）以及小鼠黑色素melan-a细胞外泌体（标记为melan-Exo）,通过透射电镜负染色法直接观察所提取的外泌体的结构以及形态,使用纳米颗粒跟踪分析仪检测两种外泌体的粒径分布,并通过Western blott法鉴定外泌体表面标志蛋白CD63,CD81的表达,从而确定外泌体的分离和纯化可靠。

2、运用CM-Dil红色荧光染料标记B16-Exo和melan-Exo,与用DAPI标记细胞核的小鼠淋巴管内皮SVEC4-10细胞共孵育,荧光显微镜下观察受体细胞对外泌体的摄取情况。以PBS作为空白对照,melan-Exo为阴性对照,在体外探究B16-Exo对SVEC4-10细胞的作用:（1）CCK-8法检测外泌体对淋巴管内皮细胞增殖的影响;（2）TUNEL染色法检测外泌体对淋巴管内皮细胞凋亡的影响;（3）Transwell迁移实验检测外泌体对淋巴管内皮细胞迁移能力的影响;（4）Tube Formation小管形成实验检测外泌体对淋巴管内皮细胞形成淋巴管能力的影响。（5）RT-PCR和Western Blot检测不同处理组中淋巴管内皮细胞VEGF-C表达差异。

3、用B16-Exo以尾静脉注射的方式处理同源的C57BL/6小鼠,1ml每次（100μg/ml）,每周注射2次,持续3周,取小鼠双侧腹股沟淋巴结组织,使用免疫组织化学染色检测腹股沟淋巴结中的淋巴管内皮标志物LYVE-1的表达,统计淋巴管阳性区域的面积,确定淋巴管新生的情况。

4、通过测序筛选B16-Exo和melan-Exo中差异表达的microRNA,通过细胞实验验证可能作用的靶基因及机制。

结果：

1、透射电镜负染结果表明:B16-Exo和melan-Exo两种外泌体均呈近似圆形双层膜囊泡样结构,大小较为均一,呈杯托形状,外部可见清晰的双层脂质膜结构,符合外泌体的典型特征。ZetaView纳米颗粒跟踪分析仪显示外泌体的粒子直径主要集中分布于100-150nm,且通过western-blotting证实两者均可以表达外泌体标志性表面标记蛋白:CD63,CD81,内参β-actin则在细胞中表达,证明外泌体分离提取成功。

2、荧光标记观察外泌体的摄取过程,可以发现被DAPI标记细胞核的小鼠淋巴管内皮SVEC4-10细胞胞浆中可见CM-Dil红色荧光染料标记的外泌体,证明SVEC4-10细胞可以摄取B16-Exo和melan-Exo两种外泌体。（1）CCK-8增殖实验显示,相比于空白对照PBS,B16-Exo在体外能显著促进SVEC4-10细胞增殖（P<0.001）,melan-Exo也可以促进SVEC4-10细胞的增殖（P<0.05）,而B16-Exo相比于melan-Exo的促进作用更强（P<0.01）（2）TUNEL染色法结果显示:统计凋亡细胞的百分比,B16-Exo处理（9.0%±4.2%）和melan-Exo处理（12.0%±7.0%）,相较于空白对照PBS（12.9%±6.6%）对SVEC4-10细胞的凋亡均无显著影响。（P>0.05）（3）Transwell迁移实验显示:经过B16-Exo处理的SVEC4-10细胞,穿膜细胞数（337.3±23.1）显著高于melan-Exo处理组（126.4±23.8）,和空白对照组（87.9±20.0）,（P<0.001）;阴性对照melan-Exo组和空白对照组相比,穿膜细胞数差异也具有统计学意义（P<0.05）。