Β-葡萄糖醛酸苷酶(Β-GD)测定试剂盒(测内源型)的应用！

一、背景

Β-葡萄糖醛酸苷酶(Β-GD)测定试剂盒(测内源型)用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人β葡萄糖醛酸苷酶(βGD)含量。

β-葡萄糖醛酸苷酶（β-Glucuronidase,β-G或β-GD）是细胞溶酶体中的一种酸性水解酶，参与机体的生理、病理及药物代谢等过程。β-GD可水解基底膜中的主要成分-蛋白多糖，因而参与肿瘤的侵袭和转移过程。在肝细胞和胃癌组织中含量丰富。β葡萄糖醛酸苷酶活性测定，有助于病情观察和预后评价。

β-GD广泛存在于动物组织中，是一种参与肿瘤侵袭和转移过程的基质降解酶，具有水解固醇葡萄糖醛酸和酸性粘多糖等生理功能。该酶在肝细胞中含量较高。此外在胃癌组织中含量丰富，测定胃液β-GD活性对于研究胃癌具有重要的意义。

二、操作规程

1、在96孔板加入细胞00μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入00微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入00微升5000～0000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置375%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、加入适当浓度的0～0μL受试化合物。

3、将96孔板在37，含5%CO2空气及00%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT用稀释液稀释成×MTT溶液。

5、每孔加50μL×MTT溶液，在37孵育4小时，使MTT还原为甲臜。

6、吸出上清液，每孔加50μL DMSO使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm波长处检测每孔的光密度（如无570nm滤光片，可以使用560-600nm的滤光片）。

三、应用

用于新型β-葡萄糖苷酶菌株syzx4筛选、发酵及酶纯化表征和应用研究：

从腐败的玉米秸秆上分离得到一株能够发酵生产耐热耐酸性的β-葡萄糖苷酶的菌株,经过形态学和分子生物学方法的鉴定为Tolypocladium cylindrosporum syzx4。然后利用计算机辅助的方法对此菌株的发酵培养基进行了优化,菌株的筛选过程和酶的发酵过程申请了国家专利。

首先,使用Plackett-Burmans实验设计法对碳源、氮源和无机盐进行产酶显著性的分析,培养基组分对β-葡萄糖苷酶生产影响排序为：TCS>KH2PO4>SM=（NH4）2SO4;然后应用计算机辅助模型拟合的方法对培养基进行进一步的优化,建立的模型包括响应面法和人工智能,人工智能模型表现的非常优异,得到的最佳培养基组成为：TCS 26.274 g/L,SM 7.066 g/L,KH2PO41.991 g/L,（NH4）2SO42.328 g/L,其它成分保持原始值,30,初始pH值为5时,发酵8天,此时发酵生产的β-葡萄糖苷酶活力可以达到2.714U/mL。

接下来对Tolypocladium cylindrosporum syzx4发酵生产的β-葡萄糖苷酶进行纯化、性质分析、糖化和同步糖化发酵气爆玉米秸秆的应用研究。酶的纯化过程采用的是硫酸铵沉淀法,DEAE-52纤维素离子交换法和Sephadex G-100凝胶层析法。纯化后相对于纯化前的粗酶液活力提高了9.47倍,回收率为12.27%,得到的酶活力为40.50U/mL。

SDS-PAGE结果显示为分子量为58.6 kDa的一条带,表明达到了电泳纯,Native-PAGE的结果表明此β-葡萄糖苷酶表现出良好的生物活性。酶学性质分析以β-葡萄糖苷酶对常用的三种水解底物为对象即纤维二糖,水杨素和p-NPG,研究了酶的水解性质,水杨素为底物时Km为8.8 mmoL/L Vmax为25.6 mmoL/s和Kcat为53.89 s-1；以纤维二糖为底物时得到Km为2.59mmoL/L、Vmax为45.3 mmoL/s和Kcat为95.37s-1；对硝基苯-β-D葡萄糖苷（p-NPG）为底物时得到Km为0.85 mmoL/Lmax为85.23 mmoL/s和Kcat为179.43s-1；以p-NPG为底物时,酶对葡萄糖的抑制常数Ki为3.95 mmoL/L,对葡萄糖醛酸内酯的抑制常数Ki为13.29μmol/L,β-葡萄糖苷水解酶具有较强的耐受葡萄糖和葡萄糖醛酸内酯的的性能,温度和pH值对酶活性的影响分析表明广泛的温度适应性在35到70反应时酶活性保留了85%以上；该酶耐酸性很强,在pH值为3.0时活力比标准测定方法提高了20%,在酸性条件下比中性条件下稳定。

最后,研究了此β-葡萄糖苷酶和其它商业化的纤维素酶复配对气爆秸秆糖化和同步糖化发酵方面的应用,经过单因子方法设计和统计学分析优化,确定糖化条件为：基质浓度为3.05%、糖化pH值为3.73、糖化温度为43.38和酶配比中β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的比例为0.91时,糖化率达到88.41%；同步糖化发酵结果证明,添加Novo-188商业化β-葡萄糖苷酶的乙醇产量比不添加β-葡萄糖苷酶的提高了50.4%,比添加同等酶活力的商业化Novo-188β-葡萄糖苷酶的乙醇产量提高了32.9%。添加Syzx4苷酶比不添加苷酶乙醇产量提高了一倍。添加Syzx4生产乙醇的速率方面也明显的优于其它两种反应体系。48h乙醇产量已经接近了17.5g/L,120h连续发酵乙醇产量可以达到23.8g/L。