ACHN人肾细胞腺癌细胞的培养步骤与应用！

一、背景

ACHN人肾细胞腺癌细胞是剪切过的人腺病毒5（Ad5）转染的人胚肾细胞形成的永生化细胞。此细胞包含并表达转染的Ad5基因。早期报道中指出该细胞基因组中含有腺病毒5（Ad5）基因组的左侧端和右侧端的DNA，但是现在明确了只存在其左侧端的DNA。经过对Ad5的插入点的克隆测序发现，Ad5的1～4344位线性核苷酸整合入细胞染色体19q13.2。该细胞为人类腺病毒载体扩增的宿主。

二、培养步骤

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于Micro RNA靶向Wnt信号通路抑制肾细胞癌增殖和侵袭作用机制的研究：

miR-384联合miR-613对肾细胞癌细胞ACHN的影响联合miR-384模拟物和miR-613模拟物,观察ACHN的增殖率;Transwell Invasion Assay法检测ACHN细胞侵袭能力;Western Bolt观察Wnt活性的改变。

结果：在肾细胞癌中miRNA-384靶向AEG-1的研究1.RT-q PCR结果显示：与癌旁肾组织相比,肾癌组织中miR-384的水平显著降低（P<0.01）。与肾微管上皮细胞株相比,在肾细胞癌细胞ACHN、A-498、786-O和Caki-1中,miR-384的水平显著降低（P<0.01）。

在ACHN和Caki-1细胞中应用miR-384模拟物和miR-384抑制剂后,RT-q PCR结果显示：与miR NC组相比,miR-384模拟物组的miR-384水平显著增高（P<0.01）。miR-384抑制剂组的miR-384水平降低（P<0.05）;

CCK8结果显示：与miR NC组相比,miR-384模拟物组细胞增殖率降低（P<0.05）。miR-384抑制剂组细胞增殖率增高（P<0.05）;细胞克隆实验和细胞侵袭实验结果显示：与miR NC组相比,miR-384模拟物组细胞数目降低（P<0.05）。miR-384抑制剂组细胞数目增高（P<0.05）;

生物信息学分析miR-384是否靶向AEG1的3’-UTR,荧光素酶报告基因结果证实野生型的AEG1 3’-UTR可以直接靶向miR-384,在野生型AEG1 3’-UTR的miR-384模拟物组的荧光强度降低（P<0.05）,而miR-384抑制剂组中荧光强度增强（P<0.05）。RT-q PCR检测肾癌组织中AEG1 m RNA的表达水平,发现与癌旁组织相比,肾癌组织中AEG1 m RNA的水平显著增加（P<0.01）。

RTq PCR和Western Blot结果显示：与miR NC组相比,miR-384模拟物组中AEG1的表达水平降低（P<0.05）,而在miR-384抑制剂组中AEG1的表达水平增加（P<0.05）。

荧光素酶报告基因结果显示：与miR NC组相比,miR-384模拟物组Wnt活性降低,而在miR-384抑制剂组中Wnt活性增高（P<0.05）。过表达AEG-1后,与miR-384模拟物组相比,miR-384 mimics+AEG-1组Wnt活性增加（P<0.05）;

CCK8结果显示：与miR-384模拟物组相比,miR-384mimics+AEG-1组细胞增殖率增加（P<0.05）;细胞侵袭实验结果显示：与miR-384模拟物组相比,miR-384 mimics+AEG-1组细胞侵袭能力增加（P<0.05）。