HFL1（人肺成纤维细胞）的背景与应用！

一、背景

HFL1（人肺成纤维细胞）是由H·Kuramoto于1968年分离的HEC-1-A细胞亚株。不同于HEC-A-1的是：HEC-1-B细胞在培养第135天到190天之间表现出稳定的生长周期，且重现扁平，与亲本细胞系相比更具铺路石样。此外，HEC-1-B细胞的主要染色体组是亲本细胞的两倍。

用75%的酒精消毒（建议配制75%酒精的水是灭菌过的）培养瓶外部。肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。显微镜观察细胞，当细胞融汇至80%左右（可以传代的情况下），细胞应该在37度培养箱预温1-2h后再做处理。如未达到细胞传代密度，培养瓶应预留一部分培养基继续培养。严格无菌操作，打开细胞培养瓶。

将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面，加入适量的0.05%胰酶-EDTA消化细胞,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。1000rpm,5min离心，重悬细胞。换新的细胞培养瓶，37,5%CO2培养。

二、应用

用于SIRT6在肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用及机制研究：

以人胚肺成纤维细胞（human fetal lung fibroblast,HFL1）为对象,研究SIRT6在HFL1细胞表型转化中的作用以及可能存在的分子机制,为寻找IPF有效的治疗靶点提供理论依据。

方法：采用Western blot检测不同浓度（1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml和15 ng/ml）的转化生长因子（transforming growth factor-β1,TGF-β1）处理HFL1细胞24 h,以及5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞不同时间（6 h、12 h、24 h、48 h和72 h）后SIRT6蛋白表达水平。

使用腺病毒过表达和shRNA沉默SIRT6后无血清处理HFL1细胞12 h,再用5 ng/ml TGF-β1处理细胞24 h,采用Western blot检测α-SMA、Collagen I、fibronectin和SIRT6蛋白表达水平。腺病毒过表达野生型和突变型SIRT6后无血清处理HFL1细胞12 h,再用5 ng/ml TGF-β1处理细胞30min,采用Western blot检测p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平,激光共聚焦扫描显微镜观察Smad2核转运的改变;5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min和60 min,采用免疫共沉淀检测SIRT6与NF-κB p65蛋白结合情况。

腺病毒过表达野生型和突变型SIRT6后无血清处理12 h,5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h,采用双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB的转录活性,实时荧光定量PCR检测NF-κB靶基因IL-1β、IL-6、MMP9的表达水平。

结果：1、TGF-β1对HFL1细胞中SIRT6蛋白表达的影响:与对照组相比,2ng/ml和5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h后SIRT6蛋白表达水平显著上调（P<0.05）,且浓度为5 ng/ml时达到最高水平。时间-效应关系实验表明5 ng/ml TGF-β1处理细胞12 h和24 h后SIRT6蛋白表达水平显著增加（P<0.05或P<0.01）,且24 h时达到最高水平。

2、过表达和沉默SIRT6对肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响:5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h后α-SMA,collagen I和fibronectin蛋白表达水平显著上调（P<0.01）。过表达SIRT6后显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA,collagen I和fibronectin蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01）。但是沉默SIRT6后仅显著增加TGF-β1诱导的fibronectin蛋白的表达水平（P<0.05）,α-SMA和collagen I蛋白表达没有改变。仅过表达或沉默SIRT6对HFL1细胞表型转化没有作用。

3、过表达SIRT6对TGF-β1/Smad2通路的作用:5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min后p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平显著上调。过表达SIRT6可显著抑制TGF-β1诱导p-Smad2蛋白表达水平（P<0.01）,但对p-Smad3蛋白表达没有作用。无去乙酰化酶活性突变体SIRT6（H133Y）未能减弱TGF-β1诱导的p-Smad2蛋白表达水平。过表达野生型SIRT6显著抑制TGF-β1诱导的Smad2蛋白核转运,但突变体H133Y无此作用。

4、过表达SIRT6对NF-κB通路的作用:SIRT6与p65相结合,并在5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min后增强。过表达野生型SIRT6而非突变体H133Y显著抑制TGF-β1诱导的NF-κB转录活性（P<0.01）,以及NF-κB靶基因IL-1β、IL-6、MMP9的表达（P<0.05或P<0.01）。

结论：TGF-β1处理HFL1细胞后,SIRT6蛋白表达呈现出一定的剂量和时间效应关系。过表达SIRT6通过抑制TGF-β1/Smad2和NF-κB信号通路削弱TGF-β1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,且依赖于SIRT6的去乙酰化酶活性。