人食管癌细胞的培养步骤与应用！

一、背景

人食管癌细胞来自人食管中段鳞癌组织，小块法原代培养建系。BALB/c裸鼠移植成瘤。

食道癌又叫食管癌，是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。食道癌分早、中、晚期；通常治疗方法有手术治疗、化疗治疗、药物治疗；食道癌饮食以营养丰富、易于消化的食物为主。其发生病因与亚硝胺慢性刺激、炎症与创伤，遗传因素以及饮水、粮食和蔬菜中的微量元素含量有关。

二、培养步骤

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于自噬介导人食管癌细胞对顺铂耐药的作用及其机制研究：

通过western blot、免疫荧光法、流式细胞仪检测酸性囊泡、透射电子显微镜法、小分子干扰RNA（siRNA）、流式细胞仪检测细胞凋亡、SA-beta-gal检测细胞衰老、MAPKs和mTORC1通路活性检测、克隆存活实验和食管癌耐药细胞裸鼠移植瘤模型等技术,深入研究自噬在人食管癌细胞对顺铂耐药中的作用及其分子机制。

1、Western blot检测LC3-和p62的表达水平

（1）检测自噬组成蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）表达水平,LC3存在两种可相互转化的形式即LC3-和LC3-II。LC-II定位于前自噬体和自噬体,是自噬体的标志分子,随自噬体膜的增多而增多。为了确定是自噬的发生而不是自噬过程（autophagy flux）受阻而引起LC3-的增加,我们拟将自噬溶酶体形成抑制剂CQ,bafilomycin A1与顺铂联合处理细胞,观察与顺铂单独处理细胞后LC3-表达的差异。

（2）检测自噬底物蛋白p62的表达水平,p62参与自噬的过程并在自噬溶酶体中降解,因此,p62蛋白水平与自噬活性成反比。具体方案为药物处理细胞后,按一系列时间点（0-48h）用RIPA裂解液裂解细胞收集蛋白,BCA测定蛋白浓度后,以50μg蛋白量上样后SDS-PAGE电泳,然后湿法转膜转印至PVDF膜,5%脱脂牛奶或BSA室温封闭1h,一抗（p62和LC3,均购自cell signaling公司）4孵育过夜,洗膜,加二抗,室温孵育1h,洗膜,ECL发光,显影,定影。

2、免疫荧光共聚焦检测LC3的分布和表达在进行免疫电镜时,样品的准备和固定是免疫电镜成败的关键。取对数生长期的EC109和EC109/CDDP细胞,以1×105/well接种于35mm共聚焦培养皿中,培养24h,吸弃培养基,药物组分为四组：1)空白对照组；2)cisplatin2.5μM;3)CQ50μM;4)cisplatin2.5μM+CQ50μM。药物处理48h后吸弃培养基。用PBS洗三遍（每遍5mmin）后,用4%多聚甲醛在室温下固定15min,用PBS洗三遍（每遍5mmin）。10%山羊血清室温封闭1h,兔源LC3一抗4孵育过夜,用PBS洗三遍（每遍5min）,加荧光抗兔二抗Alexa Fluor488IgG,室温避光孵育1h,用PBS洗三遍（每遍5min）,用DAPI室温避光染色5min,用PBS洗三遍（每遍5min）,最后一次保留PBS于培养皿中,显微镜下观察拍照。

3、吖啶橙（Acridine Orange,AO）染色检测酸性囊泡取对数生长期耐药食管癌细胞EC109/CDDP,以1×105/孔接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入2.5μM顺铂药物处理48h后,用4%多聚甲醛固定,干燥,加入终浓度为1μg/ml吖啶橙染液,染色5-10min,用PBS漂洗,在荧光显微镜下观察。由于酸度的不同,自噬溶酶体呈现红色荧光的细胞质囊泡（酸性囊泡）,而核染成绿色。

4、流式细胞仪检测酸性囊泡取对数生长期耐药食管癌细胞EC109/CDDP,以1×105/孔接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入2.5μM顺铂药物处理48h后,加吖啶橙（acridine orange）到各组EC109/CDDP细胞中,吖啶橙终浓度为1μg/ml,正常培养条件下孵育15min。移去培养基,用PBS洗1次。0.25%胰蛋白酶消化吹打细胞,1.5ml的PBS悬浮细胞,离心1500rpm×5rain。弃上清,0.5ml PBS重悬细胞,保持样本在冰上。然后上样,用流式细胞仪（BD FACSCanto TMflow cytometry,BD Biosciences,CA）检测,用FlowJo7.6软件分析。流式细胞仪检测到蓝色（488nm）激发光照射细胞后可见绿色（510～530nm）和红色（650nm）的荧光发出。

5、透射电子显微镜取对数生长期的EC109和EC109/CDDP细胞,以1×x106/dish接种于60mm培养皿中。2.5μM顺铂处理48h后,用细胞刮收集细胞,4常规低速离心10min,弃上清液。细胞沉淀以2.5%的戊二醛溶液固定过夜,再以1%四氧化锇溶液处理固定细胞2次,每次1h。最后采用梯度乙醇溶液脱水后以环氧树脂812包埋细胞,制成超薄切片（100nm厚）。用饱和的醋酸双氧铀溶液和醋酸铅染色后,在透射电子显微镜下观察细胞并摄片,观察细胞自噬体的形成。