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WI-38细胞专用培养基的应用与培养步骤!

(2022-09-17 09:48:53)
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技术

知识

应用

分类: 培养基

           WI-38细胞专用培养基的应用与培养步骤

 

 

一、背景

 

WI-38细胞专用培养基可保持WI38/VA13细胞最佳的生长状态。本产品中已包含WI38/VA13细胞生长所需的各种成分,无需添加任何成分,可直接用于WI38/VA13细胞的体外培养。

 

WI-38细胞是从女性高加索人的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系。它的培增时间为2Rh,有限寿命为Sd代。它是成纤维细胞,能产生胶原。WI-38细胞是首株用于人类疫苗制备的人二倍体细胞系,培养液中添加TNF-α可以促进WI-38细胞生长。

 

二、培养步骤

 

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

 

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

 

1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

 

2、加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

 

3、轻轻吹打细胞,完全脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

 

4、按5-6ml/瓶补加培养液,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

 

三、应用

 

用于D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老模型的建立及机制研究:

 

D-半乳糖诱导WI-38(PDL30-40)细胞衰老,以建立D-半乳糖诱导细胞衰老模型,并在此基础上探讨诱导衰老的分子机制并寻找潜在的抗衰老靶点。

 

采用MTT法测定不同浓度D-半乳糖(0,1.25,2.5,5,10,20g/L)对WI-38细胞活力的影响;SA-β-Gal染色检测不同浓度D-半乳糖(0,1.25,2.5,5,10 g/L)连续处理WI-38细胞14d后衰老状况;Western Blot法检测细胞周期抑制蛋白P21和P16和衰老标志蛋白β-gal的表达;DCFH-DA法测定不同浓度D-半乳糖对WI-38细胞总ROS水平的影响;Western Blot检测抗氧化酶、自噬标记蛋白和自噬相关通路蛋白表达。

 

D-半乳糖诱导细胞衰老模型上,采用不同浓度Mito Q进行干预,DCFH-DA法进一步测定细胞总ROS,SA-β-Gal染色检测衰老状况,Western Blot进一步检测衰老相关蛋白、抗氧化蛋白以及自噬标记蛋白表达,MDC法检测自噬。

 

结果如下:

 

1、D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老模型的建立

 

1)D-半乳糖对WI-38细胞活力具有一定的抑制作用,并且随着浓度的增高而下降。

 

2)D-半乳糖可诱导WI-38细胞衰老;不同浓度D-半乳糖作用14d后,SA-β-Gal染色细胞阳性率随着浓度的增加而增高,在5g/L浓度时达到最高。

 

3)不同浓度D-半乳糖处理14d,P21、P16和β-gal表达随着D-半乳糖浓度的增加而逐渐增高,P16和β-gal表达在5g/L浓度达到最高。

 

2、D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老机制研究

 

1)不同浓度D-半乳糖作用WI-38细胞24h,细胞总ROS随着浓度的增加而增高,并且在5g/L浓度及后续浓度处具有显著差异性。

 

2)不同浓度D-半乳糖连续处理WI-38细胞14d后,抗氧化酶SOD2、SOD1和CAT的表达随着D-半乳糖浓度的增高而降低,并且与对照组比较SOD2,SOD1,GPX1和CAT在5g/L浓度处均显著降低。

 

3)不同浓度D-半乳糖连续处理WI-38细胞14d后,在5g/L浓度处自噬标记蛋白LC3II水平降低,P62水平增高,同时自噬通路蛋白P-AMPKα(Thr172),P-ULK1(Ser555),P-ULK1(Ser757)蛋白水平降低,P-m TOR(Ser2448)和P-m TOR(Ser2481)水平增高,以上这些变化与细胞衰老呈现一定的相关性。

 

4)Mito Q可抑制D-半乳糖诱导WI-38细胞产生的ROS。

 

5)Mito Q干预后与诱导衰老组比较抗氧化酶SOD2,SOD1,GPX1和CAT表达增高。

 

6)Mito Q干预后与诱导衰老组比较自噬水平升高,自噬标记蛋白LC3II水平显著增高,与此同时P62水平显著降低。MDC结果显示诱导衰老组与对照组比较荧光强度显著降低,而Mito Q干预后荧光强度明显增强。

 

7)Mito Q干预后可降低衰老程度。连续处理14d SA-β-Gal结果显示,与诱导衰老组比较,Mito Q干预后细胞阳性率显著降低。Western Blot进一步显示Mito Q干预后P21,P16和β-gal表达,与衰老组比较表达均显著降低。


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