类干酪乳杆菌的鉴定与培养以及处理方法！

 

 

类干酪乳杆菌是Lactobacillus属的微生物，原产地为中国。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。主要用途为研究；教学；生产，具体用途为分类学研究。

 

一、菌种简介

平台编号：Bio-110958

规格：冻干物

拉丁属名：Lactobacillus Paracasei

中文名称：类干酪乳杆菌

拉丁名称：Lactobacillus paracasei

收藏时间：2020-09-16

原始编号：L3

原产国：中国

模式菌株：否

主要用途：生产胞外多糖

生物安全级别：一级

其它保藏中心编号：20245

培养基编号：58

培养温度：37

培养时间：24-48h

需氧类型：兼性厌氧

分离基物：发酵剂

保存方法：冷冻干燥管保藏

用途：生产胞外多糖

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用产品信息以出库为准

保藏条件：斜面菌种和冻干菌种应在 2-8°C 保存。请勿长期置于室温。

 

二、培养基

MRS 培养基

酪蛋白胨 10 克 牛肉浸取物 10 克

酵母提取液 5.0 克 葡萄糖 20 克

乙酸钠 5.0 克 柠檬酸二胺 2.0 克

吐温 80 1.0 克 磷酸氢二钾 2.0 克

七水硫酸镁 0.2 克 七水硫酸锰 0.05 克

碳酸钙 20.0 克 琼脂 20.0 克

蒸馏水 1.0 升 PH 6.8

如果要配制液体培养基，则不用加入碳酸钙和琼脂

 

三、类干酪乳杆菌的鉴定方法

（1）形态特征和理化特性鉴定

透射电镜、扫描电镜、光学显微镜等形态观察，培养特征观察；各种生理生化特性

（2）化学分类鉴定

细胞壁化学组分、肽聚糖种类、脂肪酸含量、细胞极性脂、醌组分分析等

（3）分子生物学鉴定

DNA-DNA杂交，（G+C）mol%含量，16S、18S、ITS等序列测定，构建系统进化树。

（4）BioLog碳源自动分析鉴定

可鉴定革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内的近2000种微生物。

（5）生物梅里埃（API）微生物鉴定系统

（6）生产菌株遗传稳定性实验

主要通过序列分析及ERIC-PCR、BOX-PCR分型证明菌株的遗传稳定性。

 

四、类干酪乳杆菌的培养方法

1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。

2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。

3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备 菌种制备。

4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。

5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入4冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。

6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。

 

五、类干酪乳杆菌的处理方法

斜面或平板：

1、拿到平板形式提供的菌种后请及时使用，或置4-15度条件下暂存，一般不超过一周，我们随附的空白平板供您应急使用。

2、若是多次使用，应制做成甘油管，放置在-70至-80冰箱或液氮中保藏。方法见下。

冻干管：

1、将安瓿管上部（非样品一端）在酒精灯上先均匀烧灼表面，然后再烧灼上部一侧；

2、灭菌水棉球点烧灼部位，出现裂纹后（注意安瓿管不要倒置）；用灭菌镊子敲开安瓿管；

3、加入液体培养基约100μL（注意管壁可能会很烫，可冷却后再加液），打匀取少许接种至适宜培养基。

附：-80和液氮保藏方法：

（1）培养：将菌种接种于合适培养基，培养基用固体或液体均可，对生长较快（如大部分弧菌、希瓦氏菌）和生长较慢的菌株用液体培养基培养比较好。培养时期掌握在对数生长期或对数生长后期。

（2）收集菌体：液体培养时，离心弃去上清液;以平板或斜面培养时，刮取菌体。

（3）保护剂：20％甘油（或20％甘油+5％海藻糖保藏效果更好）灭菌。

（4）分装：将菌体与保护剂混匀，菌体用量不能太少，混匀后看上去要浑浊；分装到若干冻存管。

（5）降温：及时放冰箱，先放-20，1-2小时后转移至-70至-80。如放入液氮中保藏，须注意样品温度降至-40以下再放。

（6）活化：从冰箱或液氮中取出甘油管后，立即放置在40温水中摇晃使冰融化，约需50秒-100秒；吸取适量内容物至适宜培养基培养。

也可从冰箱或液氮中取出后，用低温冰盒保温，牙签刮取少许冰接种至合适培养基，甘油管可再放回原处低温保藏（注意动作要快避免过度升温）。

 

六、注意事项

1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，参照“开管说明”，用无菌吸管吸取 0.3ml-0.5的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 支斜面或者平板；若接种液体培养基，则试管中液体不超过 5ml 为宜，并保持静止培养）； 经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间； 若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；

2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；

5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降应及与微生物菌种查询网联系。

6）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理；

7）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

9）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。